1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Stilbene glycosides are natural product inhibitors of FGF-2-induced angiogenesis；发表期刊：BMC Cell Biology；影响因子：未公开；研究领域：血管生成与天然产物药理学。
血管生成是指从现有血管网络生成新血管的生理过程，涉及内皮细胞基底膜降解、迁移、增殖及管腔形成，受促血管生成因子（如血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF-2）与抗血管生成因子（如内皮抑素endostatin、血栓调节蛋白thrombospondin）的动态平衡调控。生理状态下，血管生成参与伤口愈合、胚胎发育；病理状态下，其过度激活与肿瘤生长、类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变等疾病密切相关。近年来，天然产物因低毒性、多靶点作用成为血管生成抑制剂的研究热点，已报道的活性成分包括染料木黄酮（genistein）、异甘草素（isoliquitrin）、人参皂苷（ginsenoside）等，但针对FGF-2的天然抑制剂仍十分有限——已知的仅包括倍半萜（torilin）、生物碱（sinomenine）等少数类型，且机制研究尚不深入。
Boswellia papyrifera是传统药用植物，其提取物具有抗炎活性，二苯乙烯苷是其主要活性成分之一。此前研究发现二苯乙烯苷可抑制磷脂酶A2（PLA₂），但未探讨其对FGF-2诱导的血管生成的作用。本研究旨在填补这一空白，通过体外细胞模型与体内鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验，验证两种从Boswellia papyrifera分离的二苯乙烯苷（compound 1和compound 2）对FGF-2诱导的血管生成的抑制作用及分子机制，为开发新型天然血管生成抑制剂提供依据。
2. 文献综述解析
作者对现有研究的分类维度为“天然产物的化学结构与作用靶点”，涵盖二苯乙烯苷、倍半萜、生物碱等类型。现有研究的关键结论包括：①天然产物可通过抑制内皮细胞增殖、迁移或管形成发挥抗血管生成作用；②部分成分（如torilin）可特异性抑制FGF-2信号通路，但此类抑制剂数量极少；③技术方法上，结合体外细胞模型（如内皮细胞增殖实验）与体内模型（如CAM实验）可全面评估化合物活性，但FGF-2受体结合及下游信号通路的机制研究仍不充分。
本研究的创新点在于：①首次报道从Boswellia papyrifera分离的二苯乙烯苷对FGF-2诱导的血管生成的抑制作用；②明确compound 1的作用机制——通过预结合FGF-2，竞争性抑制其与FGF受体1（FGFR-1）、受体2（FGFR-2）的结合，进而下调ERK1/2磷酸化；③揭示结构-活性关系：compound 1因含有额外的鼠李糖基而更亲水，其抗血管生成活性显著强于结构类似但疏水性更高的compound 2。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的整体框架为“毒性评估→功能验证→机制解析→体内验证”：研究目标是明确二苯乙烯苷对FGF-2诱导的血管生成的抑制作用；核心科学问题是“二苯乙烯苷是否通过抑制FGF-2与受体的结合发挥作用”；技术路线遵循“体外细胞实验（增殖、迁移、管形成）→受体结合实验→信号通路检测→体内CAM实验”的闭环逻辑。
3.1 细胞毒性与增殖实验
实验目的：验证化合物对内皮细胞的毒性，及对FGF-2/VEGF/EGF诱导的细胞增殖的影响。
方法细节：①细胞毒性实验：采用MTT法（检测细胞存活率）与活性半胱天冬酶-3（active-caspase-3）免疫荧光法，以牛主动脉内皮细胞（BAEC）和人皮肤微血管内皮细胞（HDMEC）为模型，与凋亡诱导剂星形孢菌素（staurosporine）对比，孵育72小时（MTT）或24小时（caspase-3）；②增殖实验：将细胞置于含2.5%胎牛血清（FCS）的培养基中，添加FGF-2（25 ng/ml）、VEGF（10 ng/ml）或EGF（75 ng/ml），同时加入不同浓度（1.4–71.5 μM）的化合物，孵育72小时后计数细胞数量。
结果解读：①毒性实验：compound 1和compound 2对BAEC、HDMEC无显著细胞毒性（MTT法吸光度与对照组无差异，active-caspase-3阳性细胞率<5%），而staurosporine可诱导显著凋亡（阳性细胞率>30%）；②增殖实验：compound 1以剂量依赖方式抑制FGF-2诱导的BAEC增殖（半数抑制浓度IC₅₀=48.90±0.40 μM，n=3，p<0.05）和HDMEC增殖（IC₅₀=42.0±0.93 μM，n=3，p<0.05），但对VEGF或EGF诱导的增殖无影响；compound 2仅对HDMEC有弱抑制作用（IC₅₀=101.0±0.50 μM，n=3，p<0.05），对BAEC无效。
实验所用关键产品：Matrigel（Becton Dickinson）、FGF-2（R&D Systems）、VEGF₁₆₅（Apollo Cytokine Research）、EGF（Sigma）。
3.2 内皮细胞迁移与伤口愈合实验
实验目的：检测化合物对FGF-2诱导的内皮细胞迁移的抑制作用。
方法细节：①Boyden小室实验：将内皮细胞接种于上室（8 μm孔径聚碳酸酯膜，预涂明胶），下室添加含FGF-2（25 ng/ml）与化合物的培养基，孵育6小时后计数下室迁移细胞；②伤口愈合实验：将细胞培养至融合，划痕后添加FGF-2与化合物，孵育18小时后计数迁移至划痕区的细胞。
结果解读：①Boyden小室实验：compound 1抑制FGF-2诱导的BAEC迁移（IC₅₀=30.05±0.85 μM，n=3，p<0.05）和HDMEC迁移（IC₅₀=21.50±0.6 μM，n=3，p<0.05）；②伤口愈合实验：compound 1显著减少FGF-2诱导的BAEC迁移（IC₅₀=41.80±0.95 μM，n=3，p<0.05）。compound 2在两种实验中均无显著活性。
3.3 管形成与侵袭实验
实验目的：评估化合物对FGF-2诱导的内皮细胞管形成及侵袭的影响。
方法细节：①管形成实验：将细胞与Matrigel混合（1:1），添加FGF-2与化合物，孵育24小时后计数闭合管腔数；②侵袭实验：Transwell小室上室涂Matrigel，下室添加FGF-2与化合物，孵育24小时后计数侵袭细胞；③管退化实验：先让细胞形成管腔网络，再添加化合物，24小时后评估管腔退化程度。
结果解读：①管形成：compound 1抑制FGF-2诱导的BAEC管形成（IC₅₀=11.12±0.28 μM，n=3，p<0.05）和HDMEC管形成（IC₅₀=5.8±0.18 μM，n=3，p<0.05）；②侵袭：compound 1抑制BAEC侵袭（IC₅₀=11.12±0.28 μM，n=3，p<0.05），compound 2仅对HDMEC有弱抑制（IC₅₀=32.46±0.95 μM，n=3，p<0.05）；③管退化：compound 1诱导BAEC管腔退化（IC₅₀=40.0±0.2 μM，n=3，p<0.05）。
3.4 FGF受体结合实验
实验目的：验证化合物是否通过结合FGF受体抑制FGF-2信号。
方法细节：采用ELISA竞争结合实验，将可溶性FGFR-1或FGFR-2包被96孔板，化合物与FGF-2预孵育2小时后加入孔中，孵育2小时，通过检测结合的FGF-2量计算抑制率。
结果解读：compound 1预孵育可显著抑制FGF-2与FGFR-1（IC₅₀=9.32±0.729 μM，n=3，p<0.05）和FGFR-2（IC₅₀=5.37±1.04 μM，n=3，p<0.05）的结合；compound 2无此作用，且两种化合物均不影响VEGF与VEGF受体的结合。
3.5 ERK信号通路检测
实验目的：解析化合物对FGF-2下游信号通路的影响。
方法细节：采用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测phospho-ERK1/2（磷酸化 extracellular signal-regulated kinase 1/2）水平，以α-肌动蛋白（α-actin）为内参，分析化合物对FGF-2诱导的ERK激活的抑制作用。
结果解读：compound 1以剂量依赖方式降低FGF-2诱导的phospho-ERK1/2水平（28.6 μM时，phospho-ERK1/2表达较FGF-2组下降约60%，文献未明确P值，但趋势显著）；compound 2无此作用。
3.6 鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）体内实验
实验目的：验证化合物在体内的抗血管生成活性。
方法细节：4日龄鸡胚开窗，8日龄时在CAM上放置含化合物（10 μg）与FGF-2（100 ng）的甲基纤维素 pellet，14日龄时评分血管生成程度（0=无血管，3=强放射状血管）。
结果解读：FGF-2可诱导显著血管生成（评分m=3，n=15，p<0.001）；compound 1完全抑制FGF-2诱导的血管生成（m=0，n=8，p<0.0001），compound 2抑制90%（m=1，n=5，p=0.0186）；两种化合物单独使用均无炎症或血管生成活性。
4. Biomarker 研究及发现成果解析
Biomarker 定位与筛选逻辑
本研究的Biomarker为“FGF受体结合能力”与“phospho-ERK1/2水平”，筛选逻辑遵循“体外受体结合实验→信号通路验证→体内活性确认”：先通过ELISA实验筛选compound 1对FGFR-1/2的结合能力，再通过Western blot验证下游ERK通路的抑制，最后通过CAM实验确认体内活性。
研究过程详述
Biomarker来源：①FGFR-1/2来自重组蛋白；②phospho-ERK1/2来自FGF-2刺激后的内皮细胞裂解液。
验证方法：①ELISA竞争结合实验（检测化合物对FGF-2与FGFR结合的抑制率）；②蛋白质免疫印迹（检测phospho-ERK1/2的表达水平）。
特异性与敏感性：compound 1特异性抑制FGF-2与FGFR-1/2的结合（不影响VEGF受体），且剂量依赖性降低phospho-ERK1/2水平（IC₅₀与FGFR结合实验一致）。
核心成果提炼
- 功能关联：compound 1是FGF-2诱导的血管生成的天然抑制剂，其IC₅₀（5.37–48.90 μM）与已知的sinomenine（FGF-2抑制剂）相当，可显著抑制内皮细胞增殖、迁移、管形成及体内血管生成；
- 创新性：首次发现二苯乙烯苷通过“预结合FGF-2→抑制FGFR-1/2结合→下调ERK1/2磷酸化”的机制发挥作用，且结构中的鼠李糖基（增加亲水性）是活性关键；
- 应用潜力：compound 1无明显细胞毒性，体内实验无炎症反应，有望成为肿瘤等血管增生性疾病的候选治疗药物。
本研究为FGF-2的天然抑制剂家族增添了新成员，同时揭示了二苯乙烯苷的抗血管生成机制，为传统药用植物的现代化开发提供了实验依据。