1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Characterization of placental and decidual cell development in early pregnancy loss by single-cell RNA sequencing；发表期刊：Cell & Bioscience；影响因子：未公开；研究领域：生殖医学-早期妊娠丢失机制研究
早期妊娠丢失（EPL）涵盖偶发性流产与复发性流产，占临床确认妊娠的10%~15%，是生殖医学领域的常见疾病。偶发性流产主要与胚胎染色体异常相关，约半数病例为胚胎非整倍体；复发性流产指连续2次及以上妊娠丢失，占EPL的1%~3%，发病机制涉及子宫内膜或胎盘发育异常、母体免疫紊乱等多因素。领域共识：当前EPL研究热点聚焦于胎盘-蜕膜界面的细胞互作、免疫调控及多因素致病机制，但传统 bulk RNA测序技术无法解析细胞异质性，导致对EPL中细胞特异性转录组变化的认识存在空白，难以精准揭示不同细胞类型在EPL发病中的作用。针对这一核心问题，本研究采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，系统对比不同类型EPL（偶发性、复发性）与正常早孕期组织中绒毛和蜕膜的细胞发育特征，旨在解析细胞异质性对EPL发病的影响，为寻找EPL特异性生物标志物提供实验依据。
2. 文献综述解析
作者按EPL的致病类型（胚胎染色体异常、胎盘侵袭异常、母胎界面功能异常）对现有研究进行分类评述，梳理领域内研究的核心结论、技术优势与局限性。现有研究已明确EPL的主要致病因素分为三类：一是胚胎染色体异常导致的胚胎发育失败，二是滋养层细胞侵袭缺陷引发的胎盘发育异常，三是母胎界面炎症或功能紊乱导致的妊娠维持障碍。传统转录组研究发现细胞因子-趋化因子通路、线粒体超氧化物歧化酶（SOD2）等分子与EPL相关，但这类研究基于 bulk 测序技术，仅能获取细胞群体的平均转录组信号，无法区分不同细胞类型的特异性变化，存在细胞异质性解析不足的局限性。部分单细胞研究已解析正常胎盘的细胞亚型组成，但针对EPL的单细胞研究仍较为匮乏，缺乏不同类型EPL之间的细胞特征对比分析。本研究的创新价值在于首次采用scRNA-seq技术，系统解析偶发性流产（含有无胎心两种亚型）、复发性流产与正常早孕期组织的细胞簇组成与基因表达差异，聚焦绒毛与蜕膜细胞的发育异质性，填补了EPL细胞特异性转录组研究的空白，为EPL的机制研究与生物标志物筛选提供了新的技术视角。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的核心目标是解析不同类型EPL中胎盘与蜕膜细胞的发育特征及细胞异质性，核心科学问题为EPL中细胞簇组成、基因表达及细胞互作的异常如何参与发病，技术路线遵循“样本分组→单细胞制备→测序分析→细胞聚类与功能解析→结论”的闭环逻辑，通过scRNA-seq技术全面解析EPL的细胞层面致病机制。
3.1 样本分组与单细胞悬液制备
实验目的是建立不同类型EPL与正常对照的样本队列，制备符合scRNA-seq要求的高质量单细胞悬液。方法细节上，研究纳入4组样本，每组5例：A组为无胎心的早期偶发性流产，B组为有胎心后丢失的早期偶发性流产，C组为复发性流产，D组为正常早孕期人工流产对照。收集绒毛与蜕膜组织后，采用含0.125%胰蛋白酶、0.05%IV型胶原酶和0.04%DNase的混合酶液在37℃条件下分阶段消化，经40μm细胞筛过滤、红细胞裂解后，制备单细胞悬液，通过台盼蓝染色计数检测细胞活力。结果显示，四组的平均细胞数与活力分别为33.9/89.8、52.4/86.6、73.6/88、38.1/83（×10^4/活力%），均满足10×Genomics scRNA-seq平台的实验要求。实验所用关键产品：Miltenyi Biotec的MACS组织保存液，Sigma-Aldrich的胰蛋白酶、IV型胶原酶、DNase，Corning的40μm细胞筛。
3.2 scRNA-seq测序与数据处理
实验目的是获取单细胞转录组数据并完成标准化处理与初步分析。方法细节上，采用10×Genomics Chromium单细胞3’试剂试剂盒构建测序文库，在Illumina PE150平台完成测序；原始数据通过CellRanger V3.0.2处理后，采用Seurat V3.0进行细胞聚类与标记基因分析，Monocle进行细胞发育拟时序分析，WGCNA进行基因共表达网络分析，Cyclone分析细胞周期阶段，Scanpy分析细胞-细胞互作，DAVID、KEGG、GO数据库进行功能注释与通路富集，PCA和UMAP用于数据可视化。结果显示，研究共测序得到217649个基因，其中A组40705个、B组51506个、C组43755个、D组75683个；通过PCA分析与标记基因表达特征，可有效区分四组样本的分子特征，UMAP可视化结果显示四组的细胞簇组成存在显著差异。
实验所用关键产品：10×Genomics的Chromium单细胞3’试剂试剂盒、CellRanger软件，Illumina PE150测序平台，Seurat、Monocle等生物信息学分析工具。
3.3 细胞簇组成与差异分析
实验目的是解析不同组别中细胞簇的组成差异，明确EPL中异常富集的细胞类型。方法细节上，基于已报道的胎盘细胞标记基因，对细胞簇进行注释，对比四组样本的细胞簇比例与亚型分布特征。结果显示，EPL组（A、B、C）中最富集的三类细胞为绒毛细胞滋养层1（VCT1）、蜕膜巨噬细胞1（dM1）和霍夫鲍尔细胞1（HB1），而正常对照组（D）中最富集的细胞为绒毛外滋养层3（EVT3）。具体比例数据：VCT1在A、B、C、D组分别为16.68%、15.74%、12.25%、14.54%；dM1分别为15.21%、13.65%、13.14%、4.35%；HB1分别为10.07%、9.04%、11.55%、4.92%；EVT3分别为6.99%、8.80%、5.75%、16.23%。统计分析显示，EPL组中巨噬细胞（dM1和HB1）的比例显著高于对照组（P<0.001），提示免疫反应在EPL发病中起关键作用；A、B组中VCT1比例高于EVT3，提示偶发性流产中滋养层细胞从VCT向EVT的分化存在延迟（P<0.005）。此外，D组特有的细胞簇包括CTB1、PV1、PV2、树突状细胞、T细胞，而A组特有的细胞簇包括浆细胞、部分单核细胞。
3.4 细胞标记基因与功能通路分析
实验目的是鉴定不同细胞簇的特异性标记基因，解析EPL中异常激活的功能通路。方法细节上，通过RidgePlot、DotPlot分析各细胞簇的Top10标记基因，采用GSVA进行通路富集分析，Monocle进行细胞发育拟时序分析。结果显示，滋养层细胞中，VCT1的标记基因PAGE4、PEG10等在所有组中均有表达，PHLDA2、NGFRAP1仅在EPL组表达；STB1的标记基因具有组特异性；EVT3的标记基因HLA-G在C、D组表达，A、B组不表达。巨噬细胞中，HB1的标记基因ApoE在EPL组表达，对照组HB1的标记基因主要与红细胞相关；dM1的标记基因CCL20在EPL组表达，CCL2、CCL3、CCL4仅在对照组表达。通路富集分析显示，EPL组中滋养层细胞的代谢通路（如类萜骨架生物合成、糖酵解）、巨噬细胞的糖鞘脂生物合成等通路显著富集；拟时序分析显示，EPL组中滋养层细胞的分化分支点更多，巨噬细胞的发育状态更复杂。此外，SOD2在EPL组的滋养层细胞和巨噬细胞中表达显著升高，提示氧化应激参与EPL发病。
3.5 细胞互作与细胞周期分析
实验目的是解析不同组别中细胞间的互作差异及细胞周期状态。方法细节上，采用Scanpy分析细胞-细胞互作，Cyclone分析细胞周期阶段（G1、S、G2M）。结果显示，细胞互作分析显示，A组中VCT与单核细胞、NK细胞等存在互作，而C组中VCT与HB细胞存在直接互作；细胞周期分析显示，对照组中多数细胞处于G1期，EPL组中多数细胞处于S期，提示EPL中细胞增殖状态存在异常。此外，NK细胞标记基因GZMA仅在偶发性流产组（A、B）表达，可用于区分偶发性与复发性流产。
4. Biomarker研究及发现成果
Biomarker定位
本研究中潜在的Biomarker包括细胞类型特异性标记基因与差异表达基因，筛选逻辑为：基于scRNA-seq数据鉴定不同EPL组与对照组的差异表达基因→结合细胞簇注释明确基因的细胞特异性→分析基因与EPL发病的功能关联，形成“数据库筛选→单细胞转录组验证→功能关联分析”的完整逻辑链条。
研究过程详述
研究中Biomarker的来源为临床早孕期绒毛与蜕膜组织样本，验证方法为scRNA-seq转录组分析及标记基因的可视化验证（RidgePlot、DotPlot）。特异性与敏感性数据显示，滋养层细胞中，PHLDA2、NGFRAP1仅在EPL组表达，具有EPL特异性；巨噬细胞中，ApoE在EPL组的HB1中高表达，CCL20在EPL组的dM1中高表达；NK细胞标记基因GZMA仅在偶发性流产组（A、B）表达，可作为偶发性与复发性流产的区分标记。此外，SOD2在EPL组的滋养层细胞和巨噬细胞中表达显著升高，其表达水平与氧化应激反应直接相关。
核心成果提炼
本研究首次鉴定了不同类型EPL中特异性的细胞簇标记基因，包括PHLDA2、NGFRAP1（EPL滋养层细胞）、ApoE（EPL霍夫鲍尔细胞）、CCL20（EPL蜕膜巨噬细胞）、GZMA（偶发性流产NK细胞），这些基因可作为EPL的潜在Biomarker。功能关联分析显示，这些Biomarker参与免疫调控、细胞分化、氧化应激等关键通路，提示EPL的发病与细胞特异性免疫激活、滋养层分化延迟、氧化应激增强密切相关。其中GZMA可有效区分偶发性与复发性流产，为EPL的精准分型提供了分子依据。目前研究未提供ROC曲线、敏感性与特异性的临床验证数据，需进一步在大样本临床队列中验证这些Biomarker的诊断效能。