1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Leishmaniases diagnosis: an update on the use of immunological and molecular tools；发表期刊：Cell & Bioscience；影响因子：未公开；研究领域：热带病与寄生虫病（利什曼病诊断）
利什曼病是由利什曼原虫属的专性细胞内寄生原虫引起的人畜共患寄生虫病，主要分为内脏利什曼病（VL）、皮肤利什曼病（CL）和黏膜利什曼病（ML）三种类型。领域共识：全球每年新发内脏利什曼病病例约0.2-0.4百万，皮肤利什曼病约0.7-1.2百万，大量病例因诊断不足被漏报，该病被列为第九大传染病负担的被忽视热带病，严重影响全球公共卫生。当前利什曼病的诊断依赖临床特征、流行病学史与实验室检查的结合，但缺乏公认的诊断金标准，传统病原学检查（如镜检、培养）存在敏感性低、假阴性率高的问题，易导致治疗延误，进而维持寄生虫的传播循环。现有诊断手段中，免疫学方法存在交叉反应、免疫抑制患者准确性下降等局限，分子诊断方法虽具备高敏感性和特异性，但因实验室标准化不足、设备与技术要求较高等问题，难以在基层医疗场景广泛推广。针对这一研究空白，本综述系统梳理了经典与新型的免疫学、分子诊断工具的研究进展，分析其性能特点、临床应用场景及局限性，旨在为优化利什曼病诊断策略提供参考。
2. 文献综述解析
作者以诊断工具的技术类型为核心分类维度，将现有利什曼病诊断研究划分为免疫学工具和分子工具两大方向，进一步细分为经典技术与新型技术两个层次，系统对比了不同方法的诊断性能、适用场景及存在的不足。
现有研究的关键结论显示，经典免疫学方法中，Montenegro皮肤试验（MST）是皮肤利什曼病筛查的常用手段，但对近期病灶、弥漫型病变及免疫抑制患者易出现假阴性，且在流行区因亚临床感染存在假阳性；间接免疫荧光试验（IFA）敏感性较高但特异性不足，易与其他锥虫病发生交叉反应；酶联免疫吸附试验（ELISA）的诊断性能高度依赖抗原选择，其中重组rK39抗原对内脏利什曼病的诊断特异性达100%、敏感性96%，可用于HIV与利什曼病共感染患者的治疗监测；快速诊断试验（RDTs）操作简便、结果快速，适合现场筛查，但仍需结合其他方法进行确诊。新型免疫学方法中，流式细胞术（FC）在犬内脏利什曼病诊断中表现出优异的特异性与敏感性，对其他病原体感染的动物及疫苗接种犬均无假阳性结果，在人类皮肤利什曼病诊断中也展现出良好的应用潜力。分子诊断领域，聚合酶链反应（PCR）及其变体（巢式PCR、实时定量qPCR）的诊断性能显著优于传统病原学方法，可实现利什曼原虫的物种鉴定、治疗效果监测及寄生虫载量定量；等温扩增技术（LAMP）无需复杂热循环设备，适合基层现场应用，但部分研究显示其在犬内脏利什曼病诊断中敏感性较低；核酸序列依赖扩增（NASBA）可实现寄生虫载量定量，但操作流程相对复杂。现有研究的局限性主要体现在：免疫学方法普遍存在交叉反应风险，对免疫抑制患者诊断准确性下降；分子诊断方法易受临床样本中抑制剂的影响，且不同实验室间缺乏标准化操作流程，设备与技术门槛较高，难以在资源有限地区推广。本研究的创新价值在于，首次系统整合了近十年利什曼病免疫与分子诊断的最新研究成果，对比了不同技术的优劣，提出了针对不同利什曼病类型及特殊人群的组合诊断策略，为解决当前诊断金标准缺失的问题提供了可行路径。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究以“解决利什曼病诊断金标准缺失、提升诊断准确性与可及性”为核心科学问题，采用系统综述的研究思路，先明确利什曼病诊断的临床需求与现有方法的不足，再分别对免疫学和分子诊断工具的研究进展进行系统梳理与分析，最终提出优化的诊断策略建议，形成“需求分析-技术梳理-策略提出”的完整逻辑闭环。
3.1 免疫学诊断工具的系统分析
实验目的：全面评估经典与新型免疫学诊断方法在不同类型利什曼病中的诊断性能、适用场景及局限性，为临床应用提供依据。
方法细节：作者系统检索了相关数据库中关于利什曼病免疫学诊断的研究文献，筛选并分析了涉及MST、IFA、ELISA、RDTs及流式细胞术等方法的临床研究数据，重点关注各方法的敏感性、特异性、操作难度及临床应用范围。
结果解读：经典免疫学方法中，MST对皮肤利什曼病的诊断具有一定价值，但对发病初期的病灶、弥漫型病变及免疫抑制患者的检测结果为阴性，且在流行区因亚临床感染易出现假阳性；IFA的敏感性较高，但特异性不足，易与克氏锥虫等其他寄生虫病发生交叉反应，因此逐渐被更特异的方法替代；ELISA中，重组rK39抗原对内脏利什曼病的诊断敏感性为96%、特异性100%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），且可用于HIV共感染患者，其抗体水平随治疗成功快速下降；RDTs如TRALd（结合rK39与K26抗原）的诊断敏感性达100%、特异性98%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），操作简便且稳定性强，适合现场大规模筛查，但仍需结合ELISA或IFA等方法进行确诊。新型流式细胞术在犬内脏利什曼病诊断中表现出极高的特异性与敏感性，对其他病原体感染的动物及疫苗接种犬均无假阳性结果；在人类皮肤利什曼病诊断中，流式细胞术检测抗活虫或固定虫体抗体的敏感性分别达93.6%和86%-90%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），且在治疗后监测中性能优于IFA。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用的试剂包括重组rK39抗原、荧光标记二抗、流式细胞术荧光抗体等，仪器包括酶标仪、流式细胞仪等。
3.2 分子诊断工具的系统分析
实验目的：系统梳理PCR及其变体、等温扩增、NASBA等分子诊断技术在利什曼病诊断、物种鉴定及治疗监测中的应用，对比不同技术的性能与适用场景。
方法细节：作者分析了各类分子诊断技术的临床研究数据，包括不同样本类型（血液、骨髓涂片、尿液、皮肤活检、结膜拭子等）的检测效果，以及不同分子靶点（kDNA、ITS-1、SSU rDNA等）对诊断性能的影响，重点关注技术的敏感性、特异性、操作难度及可及性。
结果解读：PCR及其变体是当前分子诊断的核心技术，常规PCR对人类内脏利什曼病的诊断敏感性为53.7%-97.78%、特异性61.82%-100%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），对犬内脏利什曼病的敏感性为72.2%-98.7%、特异性83.3%-96.4%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测）；实时定量qPCR的敏感性更高（91.3%-100%），可实现寄生虫载量定量，适合治疗效果监测与复发预测；巢式PCR对黏膜利什曼病的诊断敏感性达90%，远高于直接镜检的44.4%（n=20，P<0.05），且可同时鉴定寄生虫物种。等温扩增技术LAMP无需热循环设备，适合基层现场应用，在人类内脏利什曼病及黑热病后皮肤利什曼病（PKDL）诊断中敏感性达96.4%-98.5%、特异性良好，但在犬内脏利什曼病诊断中敏感性仅54.2%，可能与靶点选择及样本处理有关；NASBA-OC技术对内脏利什曼病的诊断敏感性为79.80%-93.30%、特异性100%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），操作简便但无法实现定量。分子靶点选择方面，动质体DNA（kDNA）因每个寄生虫含10,000拷贝，诊断敏感性最高，适合大规模筛查；核糖体DNA内转录间隔区1（ITS-1）特异性更强，适合利什曼原虫的物种鉴定。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用的试剂包括Taq DNA聚合酶、荧光染料/探针、核酸提取试剂盒等，仪器包括PCR仪、实时定量PCR仪、等温扩增仪等。
3.3 优化诊断策略的提出与验证
实验目的：基于现有诊断工具的性能特点，提出针对不同利什曼病类型及特殊人群的组合诊断策略，提升诊断的准确性与可及性。
方法细节：作者结合免疫学与分子诊断工具的优势与局限，针对皮肤利什曼病、内脏利什曼病、HIV与利什曼病共感染患者分别设计了组合诊断方案，并分析了各方案的临床应用价值。
结果解读：对于皮肤利什曼病患者，若MST检测阳性但病原学检查（镜检、培养）阴性，建议联合实时定量qPCR和/或流式细胞术进行确诊，以提升诊断敏感性；对于内脏利什曼病患者，若临床特征高度提示感染但血清学筛查阴性，建议在参考中心采用实时定量qPCR检测尿液或结膜拭子样本，替代侵入性的骨髓活检，减少患者痛苦；对于HIV与利什曼病共感染的免疫抑制患者，需定期通过实时定量qPCR监测寄生虫载量，以预测治疗失败与疾病复发，及时调整治疗方案。该组合策略充分发挥了不同诊断工具的优势，可有效提升诊断的敏感性与特异性，同时降低诊断的侵入性。
产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用的设备包括实时定量PCR仪、流式细胞仪等。
4. Biomarker研究及发现成果解析
文献中涉及的Biomarker主要包括利什曼原虫特异性蛋白抗原和核酸靶点两类，通过“序列筛选-体外验证-临床样本评估”的完整逻辑链条，明确了不同Biomarker的诊断性能与应用场景。
Biomarker定位：蛋白类Biomarker包括重组rK39、K26、gp63、gp70、gp72及A2蛋白，核酸类Biomarker包括kDNA、ITS-1、SSU rDNA等，其中rK39和kDNA是当前临床应用最广泛的核心Biomarker。筛选与验证逻辑为：基于利什曼原虫的特异性基因序列，重组表达或纯化目标蛋白，或设计特异性核酸引物，通过体外实验验证其与利什曼原虫的结合特异性，再通过大样本临床研究评估其诊断敏感性与特异性。
研究过程详述：蛋白类Biomarker的来源为利什曼原虫的重组或纯化蛋白，验证方法包括ELISA、免疫层析试验、流式细胞术等。其中rK39抗原通过ELISA检测时，对内脏利什曼病的诊断敏感性为96%、特异性100%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），可用于HIV共感染患者，其抗体水平随治疗成功显著下降；TRALd试验结合rK39与K26抗原，对内脏利什曼病的诊断敏感性达100%、特异性98%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），适合现场筛查。核酸类Biomarker的来源为患者血液、骨髓、尿液、皮肤活检等样本中的利什曼原虫DNA/RNA，验证方法包括PCR、qPCR、LAMP、NASBA等。kDNA靶点的qPCR检测对犬内脏利什曼病的诊断敏感性达100%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），对人类皮肤利什曼病的诊断敏感性显著高于传统镜检；ITS-1靶点通过PCR结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析，可实现利什曼原虫的物种鉴定，为治疗方案选择提供依据。
核心成果提炼：rK39蛋白是内脏利什曼病诊断的高特异性Biomarker，可作为HIV共感染患者治疗监测的指标；kDNA是敏感性最高的核酸Biomarker，适合大规模筛查与治疗效果监测；流式细胞术检测的抗利什曼原虫抗体是犬内脏利什曼病诊断的高特异性Biomarker，无交叉反应。本研究的创新性在于，系统对比了不同类型Biomarker的诊断性能，提出了基于Biomarker的组合诊断策略，为解决利什曼病诊断金标准缺失的问题提供了关键依据。其中，rK39抗原的诊断特异性达100%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），kDNA靶点的qPCR检测敏感性达100%（犬内脏利什曼病样本，文献未明确样本量，基于图表趋势推测），为临床诊断提供了可靠的技术支持。