1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：Tunable PhenoCycler imaging of the murine pre-clinical tumour microenvironments；发表期刊：Cell & Bioscience；影响因子：未公开；研究领域：肿瘤微环境空间生物学、临床前小鼠模型高复用成像
过去20年，肿瘤微环境（TME）在肿瘤进展、免疫逃逸及治疗响应中的核心作用逐渐被认知，领域核心认知从仅关注肿瘤细胞的致癌突变，发展到重视TME中免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞等非肿瘤成分与肿瘤细胞的互作。当前研究热点聚焦于TME的空间结构对免疫功能的调控，以及空间表型与治疗响应的关联，但现有技术存在明显局限：多参数流式细胞术是TME免疫表型分析的主流方法，可实现高通量细胞分群，但需解离组织，完全丢失细胞的空间位置信息；传统免疫荧光（IF）成像能保留组织架构，但通常仅能检测1-2种标记，无法全面解析复杂TME的细胞组成。近10年高复用组织成像技术快速兴起，其中PhenoCycler（原CODEX）平台可实现高达101种标记的单细胞空间表型分析，已在人多种肿瘤及非肿瘤组织中广泛应用，但针对临床前小鼠模型的应用局限于新鲜冰冻组织，而大量科研团队存档的临床前研究组织以福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）形式保存，这一方法学空白限制了存档资源的再利用，也增加了重复造模的成本与伦理负担。本文旨在开发适用于小鼠FFPE组织的可调PhenoCycler抗体面板及开源数据分析流程，利用存档组织开展TME空间表型分析，为临床前肿瘤研究提供高效的空间生物学工具。
2. 文献综述解析
作者对领域内现有研究的分类维度包括技术类型（流式细胞术、传统免疫荧光、高复用成像）、组织保存形式（新鲜冰冻vs FFPE）、研究物种（人vs小鼠），通过多维度对比梳理现有研究的优势与局限，凸显本研究的方法学创新价值。
现有研究的关键结论可分为三类，一是流式细胞术作为TME免疫表型分析的金标准，能精准量化免疫细胞亚群的比例，但无法提供细胞间的空间互作信息，难以解析TME的结构功能关联；二是传统免疫荧光成像可保留组织的空间架构，但标记数有限，无法同时解析TME中多种细胞类型的互作；三是PhenoCycler等高复用成像技术已在人皮肤T细胞淋巴瘤、结直肠癌、黑色素瘤等多种肿瘤及溃疡性结肠炎、阿尔茨海默病等非肿瘤组织中应用，实现了单细胞水平的TME空间表型解析，但针对小鼠组织的应用仅局限于新鲜冰冻样本，FFPE小鼠组织的高复用成像缺乏标准化的抗体优化、偶联及成像流程。现有技术的优势在于，流式细胞术的高通量细胞分群能力、PhenoCycler的高标记数空间成像能力；局限性则体现在流式的空间信息丢失、传统IF的低标记数、小鼠FFPE组织高复用成像的方法学空白。本研究的创新价值在于，首次建立并验证了适用于小鼠FFPE组织的可调PhenoCycler抗体面板，构建了从抗体筛选、寡核苷酸barcode偶联到成像及开源数据分析的完整流程，填补了小鼠FFPE组织高复用空间成像的方法学空白，为利用存档临床前组织开展空间生物学研究提供了可行方案。
3. 研究思路总结与详细解析
本研究的整体框架以“方法学建立-样本验证-生物学发现”为闭环，研究目标是开发小鼠FFPE组织的PhenoCycler高复用成像方案并应用于多种肿瘤模型的TME空间分析，核心科学问题包括如何实现小鼠FFPE组织的高特异性高复用成像、不同肿瘤模型TME的空间组成及细胞互作差异，技术路线涵盖抗体筛选与验证、抗体偶联与优化、FFPE组织染色成像、开源数据分析、多模型TME比较分析五个关键环节。
3.1 抗体筛选与免疫荧光验证
该环节的核心目标是筛选适用于小鼠FFPE组织的抗体克隆，验证其染色特异性与信噪比（SNR）。方法细节为取4μm厚的小鼠FFPE组织切片，依次进行脱蜡（二甲苯或HistoChoice替代）、梯度乙醇复水、抗原修复（Tris-EDTA缓冲液pH9.0，90℃处理20min），随后进行双重封闭：先用Primary Blocking Buffer室温封闭30min，再用FC Blocking Buffer室温封闭30min；一抗以10μg/mL浓度（约1:100稀释）在4℃湿度箱中孵育过夜，次日加入AlexaFluor647标记的二抗室温孵育1h，最后用DAPI复染细胞核，使用与PhenoCycler配套的Fusion显微镜成像。结果解读显示，通过与ProteinAtlas数据库的染色模式对比，结合病理学家的评估，最终筛选出16种抗体，可覆盖TME中的主要细胞类型，包括肿瘤细胞（Ki67、c-Myc）、内皮细胞（CD31）、成纤维细胞（αSMA）、髓系细胞（CD11b、F4/80、CD11c、MPO）、淋系细胞（CD3、CD4、CD8、FoxP3、CD19），所有抗体的染色模式符合预期，SNR满足后续寡核苷酸barcode偶联的要求。产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用抗小鼠免疫细胞、基质细胞及肿瘤细胞标记的单克隆抗体，以及免疫荧光染色相关缓冲液与封闭试剂。
3.2 抗体与寡核苷酸Barcode偶联及验证
该环节的核心目标是将筛选后的抗体与PhenoCycler特异性寡核苷酸barcode偶联，并验证偶联效率。方法细节为使用Akoya Biosciences的抗体偶联试剂盒，先将抗体通过50kDa MWCO柱脱盐去除载体蛋白，随后加入抗体还原混合液室温处理30min，再加入预制备的barcode溶液室温孵育2h，通过三次纯化去除未结合的barcode，最后将偶联抗体洗脱至抗体储存液中；通过10% SDS-PAGE凝胶电泳验证偶联效率，对比未偶联抗体与偶联抗体的分子量迁移差异。结果解读显示，偶联抗体的分子量较未偶联抗体明显上移，表明barcode偶联成功；根据前期免疫荧光实验的SNR结果，为不同抗体匹配了对应的荧光报告基团：SNR高的抗体偶联AF750标记的报告基团，低丰度抗原的抗体偶联AF647标记的报告基团，中等丰度抗原的抗体偶联ATTO550标记的报告基团，以确保成像信号的均衡性。产品关联：实验所用关键产品：Akoya Biosciences的PhenoCycler抗体偶联试剂盒、寡核苷酸barcode及荧光报告基团试剂。
3.3 FFPE组织PhenoCycler染色与成像优化
该环节的核心目标是优化偶联抗体的染色条件，确保PhenoCycler成像的特异性与信噪比。方法细节为FFPE切片脱蜡、抗原修复后，用含H₂O₂的漂白溶液进行两次各45min的LED光漂白，以淬灭FFPE组织的自发荧光；随后用PhenoCycler染色缓冲液平衡组织30min，加入稀释后的偶联抗体，优化孵育条件（3h室温或4℃过夜）；手动加入对应荧光报告基团孵育5min，洗涤后成像，对比传统免疫荧光的染色结果评估成像质量。结果解读显示，优化后的染色条件下，PhenoCycler成像的信号强度与染色模式与传统免疫荧光完全一致，SNR良好，无明显非特异性染色；最终建立的16重抗体面板可同时标记TME中的所有主要细胞类型，满足后续空间分析的需求。产品关联：实验所用关键产品：Akoya Biosciences的PhenoCycler染色缓冲液、封闭试剂、荧光报告基团。
3.4 多癌种小鼠组织芯片（TMA）构建
该环节的核心目标是构建包含多种肿瘤模型的TMA，用于批量PhenoCycler成像分析，减少实验误差并提高效率。方法细节为选取淋巴瘤（A20结外淋巴瘤、Eµ-Myc nodal淋巴瘤）、乳腺癌（66cl4低转移乳腺癌、4T1高转移原发乳腺癌及肝转移灶）、黑色素瘤（BRAFV600E/PTEN-/-免疫冷黑色素瘤、YUMMER1.7免疫热黑色素瘤的IgG对照及αPD-1处理组）的FFPE组织块，先进行H&E和CD45染色，筛选免疫细胞富集的肿瘤区域，使用组织芯片制作仪取1mm直径的组织芯，构建包含84个芯的多癌种TMA。结果解读显示，该TMA覆盖了不同肿瘤类型、不同转移状态、不同免疫治疗响应的样本，为后续TME的空间表型比较分析提供了标准化的实验材料，避免了单个样本成像的系统误差。产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用组织芯片制作仪、H&E染色试剂盒、抗CD45单克隆抗体。
3.5 PhenoCycler多复用成像与开源数据分析
该环节的核心目标是对TMA样本进行PhenoCycler多复用成像，并通过开源流程实现细胞分割、分类及空间互作分析。方法细节为使用PhenoCycler-Fusion系统进行自动化成像，每个循环检测3种不同荧光标记的抗体，完成所有16种标记的成像后，系统自动进行图像拼接与背景校正，生成QPTIFF格式的多复用图像；使用开源软件QuPath v3.2进行图像分析，通过StarDist插件实现基于DAPI的单细胞分割，手动标注30-60个目标细胞及对照细胞，训练人工神经网络分类器，将细胞分为10种表型；使用CytoMAP软件进行空间邻域分析，计算50μm半径内不同细胞类型的Pearson相关系数，评估细胞间的空间互作。结果解读显示，PhenoCycler成像成功实现了所有TMA样本的16种标记同时检测，细胞分类结果与存档的流式细胞术数据高度相关（A20淋巴瘤的相关性r=0.8551，P=0.0142，文献未明确样本量，基于图表趋势推测），验证了细胞分类的准确性；空间邻域分析揭示了不同细胞类型的空间聚集或排斥关系，为解析TME的结构功能关联提供了量化依据。产品关联：实验所用关键产品：Akoya Biosciences的PhenoCycler-Fusion成像系统；开源分析软件QuPath v3.2、CytoMAP。
3.6 不同肿瘤模型TME的空间表型分析
该环节的核心目标是比较不同肿瘤模型、不同转移状态、不同免疫治疗响应样本的TME细胞组成与空间互作差异。方法细节为通过QuPath统计每个样本中不同细胞表型的比例，通过CytoMAP计算细胞间的空间相关系数，生成热图展示空间互作关系，并结合成像结果可视化TME的结构特征。结果解读显示，淋巴瘤模型中，A20结外淋巴瘤的免疫细胞浸润率高达55.12%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），远高于相邻正常肝组织的16.27%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），且调节性T细胞（Treg）与CD8+T细胞的空间相关系数为0.695（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），提示二者紧密互作，而肿瘤细胞与CD8+T细胞的相关系数为-0.1289（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），提示肿瘤细胞与免疫细胞空间分离；Eµ-Myc nodal淋巴瘤的免疫细胞浸润率仅为16.41%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），远低于正常淋巴结的84.04%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），细胞间无明显空间互作关系。乳腺癌模型中，高转移4T1原发肿瘤的Ki67+增殖肿瘤细胞比例为80.65%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），显著高于低转移66cl4肿瘤的41.13%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测）；4T1肝转移灶中中性粒细胞与内皮细胞的空间相关系数为0.4064（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），显著高于原发肿瘤的0.19%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），提示中性粒细胞与内皮细胞的互作可能促进肝转移。黑色素瘤模型中，BRAFV600E/PTEN-/-免疫冷肿瘤的免疫细胞浸润率仅为11.83%（文献未明确样本量，基于图表趋势推测），细胞分布随机；YUMMER1.7免疫热肿瘤经αPD-1治疗耐药后，CD8+T细胞与Ki67+肿瘤细胞的空间相关系数从0.3529（文献未明确样本量，基于图表趋势推测）降至无显著相关性，提示肿瘤细胞与免疫细胞的空间互作丢失是耐药的重要机制。产品关联：文献未提及具体实验产品，领域常规使用上述开源分析软件进行空间生物学数据解析。
4. Biomarker研究及发现成果
本文涉及的Biomarker为肿瘤微环境中的细胞表型组成及空间互作特征，筛选逻辑是基于多癌种小鼠TMA的PhenoCycler成像数据，通过细胞分类与空间分析，鉴定与肿瘤类型、转移状态、免疫治疗响应相关的量化指标，为临床前研究的治疗靶点筛选提供空间维度的依据。
Biomarker的来源为小鼠FFPE肿瘤组织TMA样本，验证方法为PhenoCycler高复用成像结合QuPath细胞分类与CytoMAP空间分析，特异性通过传统免疫荧光验证，敏感性通过与流式细胞术数据的相关性验证（r=0.8551，P=0.0142，文献未明确样本量，基于图表趋势推测）。核心成果包括三类Biomarker：一是肿瘤类型相关Biomarker，结外B淋巴瘤（A20）中Treg与CD8+T细胞的空间相关系数（0.695，文献未明确样本量，基于图表趋势推测）可作为免疫抑制的空间Biomarker，而nodal B淋巴瘤（Eµ-Myc）中免疫细胞浸润率降低（16.41%，文献未明确样本量，基于图表趋势推测）可作为免疫耗竭的Biomarker；二是转移相关Biomarker，4T1乳腺癌肝转移灶中中性粒细胞与内皮细胞的空间相关系数（0.4064，文献未明确样本量，基于图表趋势推测）及中性粒细胞比例（0.88%，文献未明确样本量，基于图表趋势推测）可作为肝转移的Biomarker；三是免疫治疗耐药相关Biomarker，YUMMER1.7黑色素瘤αPD-1耐药后，CD8+T细胞与Ki67+肿瘤细胞的空间互作丢失可作为免疫治疗耐药的Biomarker。创新性在于首次在小鼠FFPE组织中通过高复用成像鉴定了TME的空间Biomarker，填补了临床前研究中空间Biomarker的空白，为肿瘤治疗的临床前评估提供了新的量化指标。统计学结果显示，所有空间相关系数均标注Pearson相关系数及P值，细胞比例数据基于多个TMA芯的统计（文献未明确单个模型的样本量，基于图表趋势推测）。