ELISA 用到十万倍，这支参数挺宽
Goat Anti-Mouse IgG HRP，WB 1/2000 起
板子洗完，加 TMB，十分钟后所有孔都变蓝，包括空白孔。
你把一抗稀释了两倍，空白孔还是蓝的。
问题在二抗。1/2000 的浓度，对 ELISA 来说太浓了。
同一支二抗，三种系统的浓度差
WB、IHC、ELISA 对抗体浓度的要求不是一个量级。
WB 的膜面积小，蛋白转上去的量有限，二抗要够浓才有信号。
ELISA 的孔里抗原是纯化的，包被量大，二抗浓度低两个数量级也能出数。
Ab6789 给的推荐范围把这件事写清楚了。WB 1/2000 到 1/10000，IHC-P 1/500 到 1/2500，ELISA 到 1/100000。
三段范围差了一百倍，照着一段的经验配另一段，很容易出问题。
把三个稀释段记在配液本上，比记在脑子里可靠。
配之前先看今天做的是膜还是板，再决定拿哪一盒。
这支二抗的其他参数
山羊抗小鼠 IgG H&L，HRP 标记，多克隆。
验证应用覆盖 WB、IHC-P、ELISA、ICC/IF、IP 和斑点杂交，能上的系统比较多。
产品页还提了一个细节。这支抗体可能会有少量沉淀，看起来浑浊，但不影响性能。室温避光放几个小时，沉淀会少一些，按正常流程用就行。
出现浑浊不要离心丢掉。混匀之后按正常体积取用，性能不受影响。
背景高的时候按顺序排查
先降二抗浓度。这是最省事的一步，从 1/2000 降到 1/10000，信号一般还在。
再看封闭。5% 脱脂奶粉配在 TBST 里，封一小时，比只封半小时稳。
然后看洗膜。TBST 里吐温 20 加到 0.1%，洗四次，每次五分钟。
洗膜不充分是均匀高背景最常见的原因，比抗体浓度更常见。
洗的时候液体量要够。膜贴在盒壁上，那一块就洗不到。
到了这一步还高，才回头怀疑一抗。一抗的问题通常表现为杂带，不是均匀的高背景。
底物和显影
HRP 的底物有两种。ECL 化学发光用于 WB，TMB 用于 ELISA。
TMB 显色要避光。显色时间到了加终止液，颜色从蓝变黄，半小时内读数。
超过半小时，黄色会褪，重复孔之间的差异变大。
读板前把板底擦干净。气泡和指纹都会改变读数，尤其是 450 nm 这一档。
空白孔的读数超过 0.1，整块板的可信度都要打折。读数之前先看空白，再决定要不要重配。
下次配二抗，ELISA 的板子按 1/50000 起，别跟 WB 用同一个稀释度。
关键参数
| 反应种属 | Mouse |
| 抗原名称 | IGHG1 |
| 验证应用 | WB, IHC, ELISA, IF/ICC, IP, Dot |
| 偶联标记 | HRP |
| 宿主/亚型 | Goat / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification |
| 推荐稀释 | WB 1/2000 - 1/10000；IHC-P 1/500 - 1/2500；ELISA 1/100000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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| 品牌 | 货号 | 品名 |
|---|---|---|
| Abcam | Ab6789 | Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) 本文产品 |
| Abcam | Ab205719 | Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) |
| Abcam | Ab97023 | Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) |
| Abcam | Ab97040 | Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) preadsorbed |
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