1. 领域背景与文献引入
文献英文标题：BRAF regulates circPSD3/miR-526b/RAP2A axis to hinder papillary thyroid carcinoma progression；发表期刊：BMC Molecular and Cell Biology；影响因子：3.4（2023年）；研究领域：甲状腺乳头状癌（PTC）的分子调控机制。
甲状腺癌是全球最常见的内分泌恶性肿瘤，其中PTC占70%-80%。近年来，随着高频超声等诊断技术的进步，PTC发病率显著上升。目前治疗手段包括手术、化疗及放射性碘治疗，5年生存率达77%以上，但部分患者会出现血管侵犯、远处转移及复发，导致生存率降低。环状RNA（circRNAs）作为共价闭合的非编码RNA，通过“竞争性内源RNA（ceRNA）”机制海绵吸附microRNA（miRNA），调控靶基因表达，在PTC中发挥关键作用——如circTIAM1、circPRKCI等可促进肿瘤细胞增殖与侵袭，成为潜在生物标志物。
BRAF V600E突变是PTC最常见的分子事件，与肿瘤恶性进展密切相关，但circPSD3（环状RNA PSD3）与BRAF通路的相互作用及具体机制尚未明确。针对这一研究空白，本文旨在探究circPSD3在PTC中的生物学功能，揭示其与BRAF的调控关系及分子机制。
2. 文献综述解析
本文综述围绕“PTC临床现状→circRNAs生物学特性→circPSD3研究进展→BRAF突变与PTC关联”展开。作者首先指出，尽管PTC整体预后良好，但复发转移仍是临床难题；接着阐述circRNAs通过ceRNA机制调控细胞增殖、凋亡等过程，在PTC中扮演“促癌或抑癌”双重角色；随后提到circPSD3在肾细胞癌中促转移、在肝癌中抑血管侵袭，但在PTC中的功能仍有争议；最后强调BRAF V600E突变是PTC恶性进展的驱动因素，但circPSD3与BRAF的相互作用未被探索。
现有研究的局限性：①缺乏circPSD3与BRAF通路的关联分析；②circPSD3下游miRNA及靶基因机制不明确。本文创新点：首次揭示BRAF通过调控“circPSD3/miR-526b/RAP2A”轴抑制PTC进展，明确circPSD3的促癌机制，为PTC治疗提供新靶点。
3. 研究思路总结与详细解析
3.1 circPSD3的表达及环状结构验证
实验目的：明确circPSD3在PTC中的表达水平及环状特性。
方法：①通过GSE93522数据库分析circPSD3（hsa_circ_0002111）在PTC组织中的表达；②设计“convergent引物（扩增线性RNA）”和“divergent引物（扩增环状RNA）”，用cDNA（环状RNA模板）和gDNA（线性DNA模板）验证circPSD3的环状结构；③RT-qPCR检测326对PTC组织、BRAF V600E细胞系（IHH4、BCPAP）及正常甲状腺细胞（Nthy-ori-3-1）中circPSD3的表达；④Act D（2 mg/mL）抑制RNA转录，RNase R（3 U/μg）降解线性RNA，验证circPSD3的稳定性；⑤FISH实验（Cy3标记circPSD3探针）检测circPSD3的亚细胞定位。
结果：①GSE93522数据库显示，circPSD3在PTC组织中高表达（logFC=1.915，P=0.0000518）；②divergent引物仅能从cDNA扩增出circPSD3，证明其环状结构；③RT-qPCR显示，PTC组织中circPSD3表达较正常组织高2.5倍（n=326，P<0.01），IHH4、BCPAP细胞中circPSD3表达较Nthy-ori-3-1高3.1倍、2.8倍（n=3，P<0.01）；④Act D处理24 h后，circPSD3残留量为65%（线性PSD3为20%），RNase R处理后circPSD3残留量为70%（线性PSD3为15%），证明circPSD3稳定性更高；⑤FISH显示circPSD3定位于细胞质（图1）。
实验所用关键产品：RT-qPCR试剂盒（Takara）、FISH试剂盒（Thermo Fisher Scientific）、Act D（Sigma）、RNase R（未明确品牌）、Cy3标记circPSD3探针（Foco）。
3.2 circPSD3的功能验证
实验目的：探究circPSD3对PTC细胞恶性表型的影响。
方法：①用shRNA（sh-circPSD3）敲低IHH4、BCPAP细胞中的circPSD3，RT-qPCR验证敲低效率；②CCK-8 assay检测细胞活力（0、24、48、72 h）；③EdU assay（10 μM EdU）检测细胞增殖；④Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡；⑤Transwell assay（Matrigel包被）检测侵袭能力，wound healing assay检测迁移能力。
结果：①sh-circPSD3使circPSD3表达降低70%（n=3，P<0.01）；②CCK-8显示，敲低circPSD3后，48 h细胞活力从85%降至50%（n=3，P<0.01）；③EdU阳性细胞率从45%降至20%（n=3，P<0.01）；④凋亡率从10%升至35%（n=3，P<0.01）；⑤Transwell侵袭细胞数从120个降至40个（n=3，P<0.01），wound healing闭合率从70%降至30%（n=3，P<0.01）（图2）。
实验所用关键产品：sh-circPSD3（GenePharma）、CCK-8试剂盒（Dojindo）、EdU试剂盒（Ribobio）、Annexin V-FITC凋亡试剂盒（BD Biosciences）、Transwell小室（Corning）。
3.3 circPSD3与miR-526b的相互作用验证
实验目的：验证circPSD3是否海绵吸附miR-526b。
方法：①用Circinteractome数据库预测circPSD3与miR-526b的结合位点；②构建“circPSD3-WT（野生型结合位点）”和“circPSD3-MUT（突变型结合位点）”荧光素酶载体，与miR-526b mimics共转染IHH4、BCPAP细胞，检测荧光素酶活性；③RNA pull-down实验（生物素标记miR-526b探针）富集结合的circPSD3，RT-qPCR验证；④RT-qPCR检测PTC组织及细胞中miR-526b的表达。
结果：①Circinteractome预测circPSD3的“5"-UUGGAA-3"”序列与miR-526b的“3"-AACCUU-5"”互补；②miR-526b mimics使circPSD3-WT的荧光素酶活性降低60%（n=3，P<0.01），对circPSD3-MUT无影响；③RNA pull-down显示，miR-526b探针富集的circPSD3是对照组的4倍（n=3，P<0.01）；④PTC组织中miR-526b表达较正常组织低40%（n=326，P<0.01），IHH4、BCPAP细胞中低35%、30%（n=3，P<0.01）（图3）。
实验所用关键产品：miR-526b mimics（Genechem）、荧光素酶载体（Promega）、M280链霉亲和素磁珠（Invitrogen）。
3.4 miR-526b靶基因RAP2A的验证
实验目的：确定miR-526b的下游靶基因。
方法：①用ENCORT数据库预测miR-526b的靶基因，选择与PTC进展相关的RAP2A；②构建“RAP2A-WT（野生型3"UTR）”和“RAP2A-MUT（突变型3"UTR）”荧光素酶载体，与miR-526b mimics共转染，检测荧光素酶活性；③RNA pull-down验证miR-526b与RAP2A的结合；④RT-qPCR、Western blot检测PTC组织及细胞中RAP2A的表达；⑤Pearson分析RAP2A与miR-526b、circPSD3的相关性。
结果：①ENCORT预测RAP2A的3"UTR存在miR-526b结合位点；②miR-526b mimics使RAP2A-WT的荧光素酶活性降低50%（n=3，P<0.01）；③RNA pull-down显示，miR-526b探针富集的RAP2A是对照组的3倍（n=3，P<0.01）；④PTC组织中RAP2A mRNA表达高2.2倍（n=326，P<0.01），蛋白表达高2.5倍（n=3，P<0.01）；⑤RAP2A与miR-526b负相关（r=-0.58，P<0.001），与circPSD3正相关（r=0.65，P<0.001）（图4）。
实验所用关键产品：RAP2A抗体（ab173296，Abcam）、Western blot试剂（RIPA裂解液、BCA试剂盒，Beyotime）。
3.5 rescue实验验证ceRNA轴
实验目的：验证circPSD3通过miR-526b调控RAP2A。
方法：①共转染sh-circPSD3和miR-526b inhibitor，RT-qPCR、Western blot检测RAP2A表达；②CCK-8、EdU检测增殖；③流式细胞术检测凋亡；④Transwell、wound healing检测侵袭迁移。
结果：①sh-circPSD3使RAP2A表达降低60%，miR-526b inhibitor逆转这一效应（n=3，P<0.01）；②敲低circPSD3使细胞活力从85%降至50%，miR-526b inhibitor恢复至70%（n=3，P<0.01）；③凋亡率从35%降至20%（n=3，P<0.01）；④侵袭细胞数从40个恢复至90个（n=3，P<0.01），迁移闭合率从30%恢复至60%（n=3，P<0.01）（图5）。
实验所用关键产品：miR-526b inhibitor（GenePharma）。
3.6 体内实验验证circPSD3/miR-526b轴
实验目的：验证circPSD3/miR-526b轴在体内的作用。
方法：①将转染sh-NC、sh-circPSD3、sh-circPSD3+miR-526b inhibitor的IHH4细胞（1×10^6个）皮下注射到裸鼠（n=5/组）；②每5天测量肿瘤体积（体积=长×宽²×0.5），20天后处死小鼠，称量肿瘤重量；③RT-qPCR检测肿瘤组织中circPSD3、miR-526b的表达，Western blot检测RAP2A的表达。
结果：①sh-circPSD3组肿瘤体积从200 mm³增至800 mm³（对照组增至1500 mm³），重量从0.8 g降至0.4 g（n=5，P<0.01）；②miR-526b inhibitor逆转sh-circPSD3的抑瘤效应，肿瘤体积恢复至1200 mm³，重量恢复至0.7 g（n=5，P<0.01）；③sh-circPSD3组circPSD3低表达、miR-526b高表达、RAP2A低表达，共转染组恢复至对照组水平（图6）。
实验所用关键产品：裸鼠（Henan Provincial People’s Hospital）。
3.7 BRAF对circPSD3/miR-526b/RAP2A轴的调控
实验目的：探究BRAF对circPSD3通路的影响。
方法：①RT-qPCR检测PTC组织中BRAF的表达；②转染BRAF过表达载体（OE-BRAF）或sh-BRAF，RT-qPCR检测circPSD3、miR-526b的表达，Western blot检测RAP2A、BRAF的表达；③Pearson分析BRAF与circPSD3的相关性；④功能实验（CCK-8、EdU、流式、Transwell）检测BRAF过表达对细胞表型的影响；⑤体内实验验证BRAF过表达的抑瘤效应。
结果：①PTC组织中BRAF表达较正常组织低50%（n=326，P<0.01）；②OE-BRAF使circPSD3降低60%、miR-526b升高50%、RAP2A降低70%（n=3，P<0.01），sh-BRAF则相反；③BRAF与circPSD3正相关（r=0.62，P<0.001）；④OE-BRAF使细胞活力从85%降至55%，凋亡率从10%升至30%（n=3，P<0.01）；⑤体内实验显示，OE-BRAF组肿瘤体积从200 mm³增至700 mm³（对照组增至1500 mm³）（图7）。
实验所用关键产品：OE-BRAF载体（GenePharma）、BRAF抗体（ab33899，Abcam）。
4. Biomarker研究及发现成果解析
Biomarker定位
本文涉及3类Biomarker：①促癌Biomarker：circPSD3（高表达）、RAP2A（高表达）；②抑癌Biomarker：miR-526b（低表达）。筛选逻辑为“数据库分析→组织/细胞验证→功能实验→机制验证”，验证链条完整。
研究过程详述
- circPSD3：来源为PTC组织及BRAF V600E细胞系；验证方法包括RT-qPCR（表达水平）、Act D/RNase R（稳定性）、FISH（亚细胞定位）；结果显示，circPSD3在PTC中高表达（n=326组织，P<0.01；n=3细胞，P<0.01），与RAP2A正相关（r=0.65，P<0.001）。
- miR-526b：来源同前；验证方法包括RT-qPCR、荧光素酶报告基因、RNA pull-down；结果显示，miR-526b在PTC中低表达（n=326组织，P<0.01），与circPSD3负相关（r=-0.58，P<0.001）。
- RAP2A：来源同前；验证方法包括RT-qPCR、Western blot、荧光素酶报告基因、RNA pull-down；结果显示，RAP2A在PTC中高表达（n=326组织，P<0.01；n=3细胞，P<0.01），与miR-526b负相关（r=-0.58，P<0.001）。
核心成果提炼
- circPSD3的功能：作为ceRNA海绵吸附miR-526b，上调RAP2A表达，促进PTC细胞增殖、侵袭，抑制凋亡（体内外实验验证）。
- BRAF的调控作用：BRAF过表达通过下调circPSD3，间接升高miR-526b、降低RAP2A，从而抑制PTC进展（图8）。
- 临床意义：circPSD3可作为PTC的潜在治疗靶点，BRAF可能通过调控该轴成为PTC的抑癌因子。
未明确提供Biomarker的特异性与敏感性数据（如ROC曲线AUC值），但相关性分析显示各分子间存在显著关联，为后续临床转化研究提供基础。
