荧光二抗放久了，背景会自己长出来
Goat Anti-Mouse IgG AF488，流式 1/2000
共聚焦拍出来，整片都是绿的。细胞轮廓能看见，胞浆里也蒙着一层。
你把一抗稀释了一倍，还是绿。改成只加二抗，片子依然亮。
问题不在抗体浓度。这管二抗已经冻融了十几次。
荧光基团会掉
Alexa Fluor 488 挂在小鼠 IgG 的赖氨酸残基上。反复冻融会让蛋白聚集，游离的荧光基团也会脱落。
脱落的染料不受抗体约束，洗不干净，均匀地糊在整张片子上，看起来就像高背景。
判断方法简单。只加二抗不加一抗，走一遍完整流程。整片均匀发绿，就是二抗的问题；只有细胞轮廓发绿，问题在一抗或者封闭。
这一步十分钟就能做完，比反复调一抗浓度省事得多。
但它只能定性。真要定量，还得同一批样本、同一个曝光参数下对比。参数一变，绿色深浅就没有可比性。
这支二抗的参数
Ab150113 是山羊抗小鼠 IgG H&L，Alexa Fluor 488 标记，多克隆。
验证应用覆盖 IHC、ELISA、流式和 ICC/IF。
稀释比是分开给的。流式 1/2000，ICC/IF 1/200 到 1/1000。
流式的同型对照推荐 ab170190，小鼠 IgG1 的 AF488 标记，用来扣掉非特异结合。做胞内染色时这一步尤其重要，破膜之后背景普遍偏高。
多克隆识别重链和轻链，信号强。代价是批间差异比单克隆大一些，做定量比较的课题要留意批号。
工作液配好之后离心一次，取上清。聚集的蛋白会沉在管底，留在液里就是背景。
抗小鼠二抗的坑
做多标的时候，如果一抗里有小鼠来源，另一支也是小鼠来源，一支抗小鼠二抗会把两个都染上。
解决办法是把其中一支换成兔或者山羊来源的一抗，或者用直标一抗。
山羊抗小鼠的二抗和兔来源的一抗不交叉。做双标时这一对是安全的组合，选抗体的时候可以先用这个搭配。
反过来，抗兔的二抗配小鼠一抗同样安全。做三标的时候把宿主错开排一遍，比临时加封闭步骤管用。
保存上的三条
分装之后冻在负二十度，不要放负八十度再反复拿。荧光染料怕光，分装管用铝箔包一下。
稀释好的工作液当天用完，不要留到第二天。
分装管上写日期和批号，取用的时候不用翻记录。
拍片顺序上，AF488 的激发峰在 488，和 GFP 重合。样本里如果有 GFP 标签，换 AF594 或者 AF647。
今晚把那管二抗分装成十管，每管二十微升，用完一支扔一支。
关键参数
| 反应种属 | Mouse |
| 抗原名称 | IGHG1 |
| 验证应用 | IHC, ELISA, FCM, IF/ICC |
| 偶联标记 | AF488 |
| 宿主/亚型 | Goat / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 推荐稀释 | Flow Cyt 1/2000 ab170190 - Mouse monoclonal IgG1 (Alexa Fluor ® 488), is suitable for use as an isotype control to complement this secondary antibody.；ICC/IF 1/200 - 1/1000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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