GPX4 的膜上，常见两条带
Anti-GPX4 [EPNCIR144]，兔单抗，WB 1/1000 起
铁死亡诱导剂处理 24 小时，收蛋白，跑胶。GPX4 的膜上，上面一条带明显变浅，下面那条几乎没动。
你按最短的那条定量，结论和预期对不上。
GPX4 有两种定位，分子量不一样。
两条带的来源
GPX4 基因通过可变剪接产生几种转录本。最主要的两型，一个留在胞质，一个进线粒体。
线粒体型的 N 端多一段信号肽，跑胶时位置偏上。
两种都催化脂质过氧化物的还原，但在铁死亡里的分工不同。用一条带代表总 GPX4，结论容易偏。
剪膜的时候按位置剪，上下分开孵，别整条一起压。
旁边留一泳道分子量标志物，位置才有参照。
抗体的事实
Ab125066 是 EPNCIR144 克隆，兔单克隆，IgG 亚型，识别人、小鼠、大鼠的 GPX4。
验证应用是 WB、IHC-P、流式胞内和 ICC/IF。
稀释比分开给。WB 1/1000 到 1/10000，IHC-P 1/50 到 1/250，流式胞内 1/400。
IHC 的下限给到 1/50，说明石蜡切片里这个靶点的信号不算强，浓度不能省。
省了浓度，阳性区域会变成零星几个点，看起来像阴性。
做肿瘤组织从 1/50 起，先看阳性是不是集中在胞浆。核染就是非特异。
胞浆染色不均匀也常见，肿瘤细胞和间质的强度差得大。
定量的做法
先确认两条带都在，再决定定量哪一条。
做总 GPX4，两条带一起算。做线粒体型，只算上面那条，同时用胞质标志物确认分离效果。
上样量控制在 20 到 30 微克。GPX4 在多数细胞里表达量中等，上少了下面那条容易看不见。
转膜用 0.2 微米孔径的膜。小分子量蛋白用大孔径，会直接穿过去。
转膜电流不要太大，小分子量蛋白容易过转。
曝光时间不要过。GPX4 的条带容易饱和，饱和之后组间差异会被压平，看起来像没差异。
和铁死亡指标一起看
GPX4 蛋白下降，不代表铁死亡已经发生。
还要看脂质过氧化指标，以及铁死亡抑制剂能不能把表型救回来。
rescue 实验的浓度和时间都要先摸。救不回来不等于没发生，可能只是加得太晚。
抑制剂至少提前一小时加，铁死亡的启动很快。
单独一个 GPX4 的 WB 结果，说明的是蛋白水平变了，不能直接推到表型。
做 IHC 的话从 1/50 起，先看肿瘤实质和间质的染色差异，再定量。
下一次跑 GPX4，先把两条带的位置标出来，再决定定量哪一条。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase |
| 验证应用 | WB, IHC, FCM, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/50 - 1/250 Perform heat-mediated antigen retrieval before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/1000 - 1/10000；Flow Cyt (Intra) 1/400 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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