用脱脂奶粉封闭，这支抗体会掉信号
Anti-alpha Tubulin [DM1A]，小鼠单抗
同一批样本跑两块膜。一块用 5% 脱脂奶粉封闭，一块用 3% BSA。
其他步骤一模一样。α-tubulin 的条带，奶粉那块浅了将近一半。
产品页上写得很清楚。牛奶封闭会降低这支抗体的信号，建议改用 3% BSA。
牛奶为什么会压低信号
脱脂奶粉里主要是酪蛋白，还有一些糖蛋白和生物素化的成分。
DM1A 的表位在某些条件下会和酪蛋白发生非特的相互作用，抗体被消耗掉一部分，能结合到膜上的就少了。
BSA 成分单一，没有这个问题，背景也干净。
换成 BSA 之后背景反而更低，这一步不亏。
BSA 也有批次差异，做定量实验认准一个批号。
做内参的时候这个差别会被放大，因为内参的条带本来就要求稳定。
内参要求组间一致，封闭液带来的偏差，会被当成实验差异写进结论。
换了封闭配方等于换了一个变量，前后两组数据不能直接比。
这支抗体的参数
Ab7291 是 DM1A 克隆，小鼠单克隆，IgG1 亚型，识别人、小鼠、大鼠的 α-tubulin。
验证应用是 WB、IHC-P、流式胞内和 ICC/IF。
WB 推荐 1/5000 到 1/10000。厂家建议按 1/10000 稀释、四度过夜孵育，还原和非还原条件都能用。
IHC-P 用 5 微克每毫升，ICC/IF 0.5 到 1 微克每毫升，流式胞内 1 微克对 10 的 6 次方个细胞。
IHC 按微克给浓度，配液时算一下，别直接套 WB 的稀释比。
IHC 的抗体浓度通常比 WB 高一个量级，套错了不是没信号就是满片背景。
操作上的三条
封闭用 3% BSA 配在 TBST 里，室温一小时，或者四度过夜。
四度封闭更均匀，赶时间就用室温。
一抗稀释液也用含 BSA 的缓冲液。奶粉配的稀释液，等于把刚避开的坑又踩一遍。
同一块膜上还要孵别的抗体，剪开分浴，别为了省事共用一种封闭液。
内参的选择
α-tubulin 在微管丰富的细胞里信号强，贴壁细胞和悬浮细胞都合适。
做组织样本，尤其是肌肉和脑，微管蛋白的含量差异大，内参的稳定性不如 GAPDH。
做微管相关的药物处理，α-tubulin 本身会变，这时候不能拿它当内参。
同样的道理，做细胞骨架相关的处理，任何结构蛋白内参都要重新考虑。
处理影响面广的时候，内参换一个不在这条通路上的蛋白。
明天配封闭液，从奶粉换成 3% BSA，同一批样本再跑一次，对比条带的深浅。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | TUBA1A |
| 验证应用 | WB, IHC, FCM, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Mouse / IgG1 |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification |
| 推荐稀释 | IHC-P 5 µg/mL Perform heat-mediated antigen retrieval with citrate buffer pH 6 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/5000 - 1/10000 We recommend diluting ab7291 to 1:10000 and incubating overnight at 4°C. Works under both reducing and non-reducing conditions. We recommend using 3% BSA as the blocking agent, blocking with milk may cause a reduction in signal intensity.；ICC/IF 0.5-1 µg/mL；Flow Cyt (Intra) 1 µg for 10^6 Cells ab170190 - Mouse monoclonal IgG1, is suitable for use as an isotype control with this antibody. |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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