HA 标签拉下来，多条带是正常的
Anti-HA tag，兔多抗，ChIP Grade
转染 HA 融合质粒，48 小时后收蛋白，IP 拉下来跑 WB。
膜上除了目的条带，下面还有两条弱的。
你以为 IP 不干净，换了新的珠子，还是那两条。
标签抗体的背景从哪来
HA 标签来自流感血凝素蛋白的一段表位，长度只有九个氨基酸。
融合蛋白在细胞里会被部分降解。剩下的片段只要还带着标签，就会被抗体拉下来。
过表达的蛋白还有翻译起始位点不同的截短体，也会带标签。
所以多条带不一定是杂带，可能是同一个蛋白的不同片段。
判断之前先把预期分子量算清楚，别凭印象认带。
融合标签加上去，分子量要一起算，差几千道尔顿就认错了。
这支抗体的参数
Ab9110 是兔多克隆，靶点是 HA tag，标注 ChIP Grade。
验证应用覆盖 WB、ELISA、流式、ICC/IF、IP 和 ChIP，还有 ChIP/Chip。一支抗体能从拉蛋白做到拉 DNA。
产品页没有给固定稀释比，各个系统自己摸。
IP 的用量通常按微克算，稀释比在这个系统里意义不大。
按样本的蛋白总量给抗体，比按体积给稳。
多克隆识别标签的多个位点，拉下来的效率高。代价是批间差异，一整个课题用同一批号。
判断是不是真的
要确认那条带是不是目的蛋白，看分子量对不对，看它是不是随转染量变化。
做一个空载对照，同一批 IP，空载组不应该出带。
空载组出带，说明抗体认了载体上的其他蛋白，换载体或者换标签位置。
再做输入样本，IP 前后的条带位置要能对上。
输入样本留十分之一。留太少看不出来，留太多会把膜压饱和。
输入样本也要煮沸变性，别直接上样。
三条一起看，多出来的带是降解片段还是非特异，基本能分清。
IP 的条件
裂解液用含 Triton 或者 NP-40 的缓冲液，离子强度不要太低，能压住非特异结合。
抗体和样本先孵育，再加珠子。比抗体直接挂在珠子上拉下来的背景低。
孵育两小时到过夜，看亲和力，不要一律过夜。
洗的时候盐浓度可以提高一点，末次洗换低盐，避免影响上样。
洗的次数比盐浓度更重要。四次以上，再考虑往上加盐。
洗得太狠，弱相互作用的目的蛋白会一起被洗掉。
煮沸洗脱会把 IgG 的重链和轻链一起煮下来。用直标二抗，或者选避开重链的检测方式。
用直标一抗做检测，重链的干扰就没有了。
下一次 IP，同时跑一个空载对照，那条多出来的带就有答案了。
关键参数
| 抗原名称 | HA tag |
| 验证应用 | WB, ELISA, FCM, IF/ICC, IP, ChIP |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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| 品牌 | 货号 | 品名 |
|---|---|---|
| Abcam | Ab9110 | Anti-HA tag antibody - ChIP Grade 本文产品 |
| Abcam | Ab18181 | Anti-HA tag antibody [HA.C5] |
| Abcam | Ab236632 | Anti-HA tag antibody [EPR22819-101] |
| Abcam | Ab1424 | Anti-HA tag antibody [12CA5] |
参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。