二抗稀到 1/20000，条带反而干净

Goat Anti-Rabbit HRP，WB 1/2000 起

一抗孵完，二抗按老习惯配 1/2000，室温一小时。

ECL 压上去，前 5 秒就全白，30 秒之后背景一层灰。

把二抗改成 1/20000，其他不动，同一张膜重跑，条带清楚，背景也没了。

二抗浓度为什么不能凭习惯

HRP 标记的二抗是酶促显色，信号强度和酶量不是线性关系，酶多了反而更快耗底物。

浓度高的时候，膜上每个角落都挂着酶，包括封闭没盖住的位点。ECL 一加，到处发光，相机看到的就是一片灰。

浓度降下来，非特异位点上的酶少了，背景掉得比特异信号快，信噪比反而上去。

所以二抗这一步的调节空间比多数人用的大得多。

产品页上这支二抗的宿主是山羊，靶点是兔 IgG 的整个分子，重链轻链都认。纯化方式是免疫原亲和纯化。

一支二抗的稀释区间

ab97051 是山羊抗兔 IgG 全分子，HRP 标记，多克隆。

产品页把区间分得很细。WB 通用写 1/2000 到 1/20000；括号里再分：比色法 1/5000 到 1/30000，化学发光 1/10000 到 1/50000。

免疫组化单独给一档，1/200 到 1/5000。ELISA 给的是 1/10000 到 1/100000。

同一个货号，四个系统四套数，最大跨了五十倍。这个差距不是笔误，是不同检测方式的酶需求量不同。

免疫组化是显色沉淀，酶多一点颜色深，但背景也厚。ELISA 是液相反应，抗体可以稀得很开。

这几个数字之间没有换算关系。把 IHC 的 1/200 拿到 WB 上用，背景立刻压不住，反过来也一样。

跨应用的注意点

全分子抗体带有 Fc 段，除了结合重链，也会结合轻链。做 IP 之后的 WB，膜上会多出一条 Ig 的重链或轻链，位置常常压在目的蛋白附近。

遇到这种情况，换用只识别天然构象的轻链特异性二抗，或者在样品处理时把 Ig 去掉。

多重检测时，两支二抗要选不同宿主，交叉吸附过的更好，否则换通道之后会看到另一支的影子。

换成荧光二抗时，HRP 体系不能和荧光体系比稀释度，两者的检测灵敏度差一个量级。

三条操作建议

化学发光先用 1/10000 起，信号弱再往 1/5000 走，不要一上来就 1/2000。

洗涤用 TBST，末次多洗五分钟。HRP 的背景很大一部分来自没洗掉的二抗。

IHC 上按 1/200 到 1/5000 之间试，DAB 显色时间固定，否则不同批次之间没法比。

下一张膜，二抗直接按 1/20000 配，省下来的抗体够多做十几次。

关键参数

反应种属	Rabbit
抗原名称	Rabbit IgG
验证应用	WB, IHC, ELISA, IF/ICC
偶联标记	HRP
宿主/亚型	Goat / IgG
抗体类型	Polyclonal
纯化方式	Affinity purification Immunogen
推荐稀释	IHC-P 1/200 - 1/5000；ELISA 1/10000 - 1/100000；WB 1/2000 - 1/20000 Colorimetric: 1/5000 - 1/30000; Chemiluminescent: 1/10000 - 1/50000
储存条件	短期 +4°C；长期 +4°C

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品牌	货号	品名
Abcam	Ab97051	Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) 本文产品
Abcam	Ab6721	Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)
Abcam	Ab205718	Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)
Abcam	Ab7090	Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) preadsorbed

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