GFP 拉不下来，先看标签在哪一头

Anti-GFP 多抗，WB 到免疫电镜六种应用

转染 48 小时收细胞，裂解之后加抗体过夜，第二天珠子上一看，几乎没有东西。

Western 上 GFP 信号很强，说明蛋白在，标签也在。

拉不下来，问题常出在标签被折叠挡住了。

融合蛋白的两种朝向

GFP 挂在目的蛋白的 N 端还是 C 端，决定了它暴露在溶液里的哪一面。

框进融合体之后，GFP 的桶状结构要完整折叠才有荧光。折叠完整的时候，多数表位在表面，抗体能结合；但如果融合的一方带膜结构域或者形成寡聚，GFP 可能被压进复合物的界面里。

过表达也是一个因素。蛋白量太高，形成聚集体或者包涵体，去垢剂打不开，抗体只能碰到表面的部分。

所以 WB 能看到条带，IP 拉不下来，这两件事不矛盾。WB 之前样品被煮沸变性，表位全露；IP 是在天然状态下抓。

产品页标的分子量是 27 千道尔顿，指的是 GFP 本身。融合蛋白的位置要按目的蛋白加上去算。

这支抗体的应用面

ab6556 是兔多克隆，IgG 亚型，靶点是 GFP 本身，不限于某个融合构建。

验证过的应用写了六种：WB、IHC、流式、ICC/IF、IP 和免疫电镜。

能做到电镜这一步的 GFP 抗体不多。免疫电镜要求抗体识别的表位在固定之后仍然保留，多抗在这一点上比单抗有优势，因为它认多个位点，个别位点被交联破坏也还有别的能用。

产品页没有写具体的反应种属，因为 GFP 是外源标签，种属不适用。

纯化方式是免疫原亲和纯化，液体剂型。多抗的批间差异靠每批的实测数据兜，换批之后先跑一孔确认。

拉不下来时的排查顺序

先换裂解条件。去垢剂从温和的 NP-40 换到 RIPA，看看能不能把融合蛋白从复合物里释放出来。

再换标签朝向。同一个目的蛋白做 N 端和 C 端两个构建，哪个能拉下来用哪个，这是最快的一条路。

第三个选项是交联。抗体先跟珠子交联，再孵育裂解液，可以避免重链轻链干扰判读。

珠子先用无关蛋白预孵育半小时，把非特异位点占住，背景会干净很多。

三条操作建议

IP 的裂解液里补蛋白酶抑制剂，GFP 融合蛋白容易被降解，拉下来的是片段。

免疫电镜的样品固定要兼顾膜结构和抗原性，固定过度就看不清金颗粒，固定不足膜会散。这部分的配方要按电镜平台的条件走。电镜的二抗要用金标记的小粒径颗粒，粒径大了钻不进致密结构。

流式检测 GFP 直接看荧光就行，不需要抗体。用抗体是为了放大弱信号，两者不要混着解释。

下一次做 IP，先取十分之一裂解液跑一遍 WB，确认蛋白确实进了上清。

关键参数

抗原名称	GFP
验证应用	WB, IHC, FCM, IF/ICC, IP, EM
宿主/亚型	Rabbit / IgG
抗体类型	Polyclonal
纯化方式	Affinity purification Immunogen
储存条件	短期 +4°C；长期 -20°C

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品牌	货号	品名
Abcam	Ab6556	Anti-GFP antibody 本文产品
Abcam	Ab13970	Anti-GFP antibody
Abcam	Ab290	Anti-GFP antibody
Abcam	Ab6673	Anti-GFP antibody

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