594 通道一片红，二抗先降四倍
Goat Anti-Rabbit IgG AF594，IF 1/200 起
双标做共聚焦，488 通道的目标结构很清楚，594 通道一打开，满屏都是红的。
把 594 的二抗从 1/200 稀释到 1/800，其他全部不动，红色收进了该亮的地方。
荧光二抗这一步，浓度过剩比不足更常见。
荧光二抗为什么容易过浓
Alexa Fluor 594 的亮度高，量子产率高，抗光漂白。它不像 HRP 那样有酶促放大，信号正比于分子数。
浓度高的时候，非特异结合的那部分也亮。细胞膜、胞质、细胞外基质上零散挂着的二抗，一叠加就是背景。
更麻烦的是串色。594 的激发和发射都比较宽，浓度高时泄漏到相邻通道，双标就分不开了。
这支二抗的稀释
ab150080 是山羊抗兔 IgG 全分子，Alexa Fluor 594 标记，多克隆。靶点是兔 IgG 全分子，纯化方式为免疫原亲和纯化，液体剂型。
ICC/IF 给的是 1/200 到 1/1000，流式给的是 1/2000 到 1/4000。
IHC-P 和 ELISA 写的是按实验条件决定稀释度，没有给固定数。这两类实验里，染色方式和检测设备的差异太大，厂家没办法给一个通吃的值。
流式的稀释度比 ICC 稀十倍，这是液相反应的共性，抗体在管子里扩散快，浓度低一点就能饱和。同一张片子换物镜之后亮度会变，换倍镜时要重新调曝光，不要沿用上一个倍镜的参数。
换检测平台要重摸浓度。宽场显微镜下能用的稀释度，拿到共聚焦上常常过亮，同一张片子两种设备拍出来不是一个样子。
多色搭配的注意点
594 常跟 488 和 647 一起用。三者激发峰相隔比较开，但 594 被 488 激光激发时会有一定程度的亮起，这叫交叉激发。
解决办法是在单标片上先跑一次，把每个通道的泄漏量记下来，做多标时用补偿或者顺序扫描。
还有一个更省事的办法：拍摄时把 594 的增益压到 488 的三分之一，肉眼看着平衡，通道之间也不容易溢出。
另一个选择是换到 555 或 568 通道，间隔更大。具体用哪个，看显微镜配的滤片组。
三条操作建议
ICC 从 1/500 起，比说明书下限稀一档，先看背景再决定要不要提。
封片之后当天拍，别放到第二天。抗淬灭封片剂能延长窗口，但甘油类的封片剂会轻微改变折射率，拍 Z 栈时要注意。
双标的两支二抗要选同一批次的稀释液，不同批次里的蛋白浓度差异会影响背景。
下一张片子，594 按 1/800 配，拍完再看 488。
关键参数
| 反应种属 | Rabbit |
| 抗原名称 | Rabbit IgG |
| 验证应用 | IHC, ELISA, FCM, IF/ICC |
| 偶联标记 | AF594 |
| 宿主/亚型 | Goat / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 推荐稀释 | ICC/IF 1/200 - 1/1000；Flow Cyt 1/2000 - 1/4000；IHC-P Use at an assay dependent dilution；ELISA Use at an assay dependent dilution |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
相关产品
点击货号或品名可查看生知库产品页的完整参数与报价。
参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。