BAX 做 IP，别沿用 WB 的量

BAX 兔多抗，WB、IHC、ELISA 和 IP

做 BAX 和 Bcl-2 的相互作用，IP 拉下来之后跑 WB，BAX 那条带很淡。

同学把 IP 用的抗体加到三倍，带深了一点，但 IgG 重链的干扰也跟着上来了。

他把 IP 当成了一次放大的 WB。

图 1　免疫沉淀 验证结果（图源：proteintech 官网产品页）

两种实验的逻辑不同

WB 里抗体只要结合到膜上的蛋白，浓度够就能显色。

IP 里抗体要把溶液中的蛋白拉下来，还要带着它一起沉到珠子上。抗体量不足，拉下来的蛋白就少；抗体过量，非特异的东西跟着一起沉。

两个实验的最优抗体量不在一个区间，不能互相换算。

IP 之后跑 WB 检测，检测抗体最好换一个种属或者换一个克隆，避免重链轻链盖住目标带。

重链的位置在五十千道尔顿上下，跟不少蛋白都撞。跑胶的时候把目标带的位置先估出来，撞上了就换检测抗体。

这支抗体的四个系统

产品页写的验证系统是 WB、IHC、ELISA 和 IP。

反应种属是人、小鼠、大鼠。宿主兔，多克隆，标记栏写的是未偶联。

纯化方式是抗原亲和纯化，这一类纯化的抗体在 IP 里背景相对干净。

货号后缀带 Ig，装量按产品页标注，用之前先看说明书上的浓度。

四个系统给四套条件，记录的时候分开写。IP 的用量和 WB 的稀释比写在同一行，是最常见的错误来源。

BAX 在凋亡里的位置

BAX 是 Bcl-2 家族的促凋亡成员，静息状态下在胞质里，激活之后转到线粒体外膜。

转位这一步是凋亡的关键节点。看总量变化，不如看转位。

做转位要分胞质和线粒体两个组分，分别跑 WB。差速离心先低速去核，再高速收线粒体，每一步的转速和时间都要固定，否则两组之间的比例没有可比性。

BAX 和 Bcl-2 的比值常被拿来做凋亡倾向的指标，这个比值只在同一批样本内有意义。

操作上的几条

IP 之前先做一次 WB，确认裂解液里 BAX 能被检出来。检不出来，IP 也拉不到。

裂解液用温和的非离子型去垢剂，离子型去垢剂会把蛋白复合物拆开，拉到的就不是相互作用了。

珠子先预封闭，用 1% BSA 室温摇一小时，能压掉不少非特异。

洗的次数和体积也要写进记录。洗三次和洗五次，拉下来的东西不一样，尤其是相互作用弱的复合物。

洗的时候盐浓度可以逐次提高，最后一次用高盐洗，背景会干净很多。

明天先按产品页给的量做一次 IP，同时做一个不加抗体的珠子对照，两个一起跑，看重链下面有没有目标带。

关键参数

图 2　Western blot 验证结果（图源：proteintech 官网产品页）

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参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。