AF647 二抗，流式别加太浓
Goat Anti-Mouse IgG AF647，流式 1/2000 起
八色 panel，跑出来 CD4 那一群细胞的位置飘，补偿怎么调都对不齐。
单染管看着正常，全染管就出问题。
同学把二抗从 1/1000 提到 1/500，想着信号强一点好分群。
问题反而更明显了。
二抗的浓度和信号不成正比
二抗的作用是放大。一抗已经结合上去，二抗的数量足够饱和就够了，再往上加不会让信号更强，只会让背景更亮。
背景一亮，弱阳性群和阴性群之间的边界就糊了，补偿也算不准。
这支给的流式条件是 1/2000 到 1/4000，比多数二抗稀。
稀的原因在荧光素。Alexa Fluor 647 的量子产率高，一个抗体上挂几个分子就够亮。
信号过强还有一个副作用，弱阳性群会被推到强阳性区，看上去像多了一群细胞。分群异常的时候先把二抗稀释一倍试试。
ICC/IF 是另一套
同支抗体做 ICC/IF，给的是 1/200 到 1/1000。
细胞样本在玻片上，抗体扩散受限，浓度要比流式高。
两个系统不能互相借用。流式的 1/4000 拿到玻片上，多半染不出来；玻片的 1/200 拿到管子里，背景会盖住整个图。
多色 panel 里的位置
AF647 的发射峰在远红区，和 APC 几乎重合。
同一个 panel 里不能同时用 APC 和 AF647 标记的两个抗体，除非做顺序染色。
和 BV785、PerCP 这些通道相邻的时候，补偿要单独调。远红区的自发荧光低，补偿系数容易算过。
细胞固定之后，AF647 的亮度会掉一些。胞内染色的样本要在固定后重新滴定一次，不能沿用表面染色的条件。
每加一个荧光，先做一次单染，把补偿矩阵建起来，再看全染。
同型对照要用带同样荧光的。产品页点名 ab176103，小鼠 IgG1 带 AF647，配这支正好。
滴定怎么做
二抗的滴定比一抗简单。固定一抗浓度，二抗做四个点，1/1000、1/2000、1/4000、1/8000。
看两个指标，阳性群的信号强度，和阴性群的背景。
信号曲线在某个点之后会平，背景曲线还在涨，那个拐点就是最优浓度。
定了之后写进 SOP，不同批号之间不轻易改。
二抗的批间差异比一抗小，但不是没有。换批之后跑一次全染，看阴性群的位置有没有漂，漂了再微调。
明天把这管二抗按 1/2000 和 1/4000 各做一次全染，同型对照一起跑，先看阴性群能不能压到基线附近。
关键参数
| 反应种属 | Mouse |
| 抗原名称 | IGHG1 |
| 验证应用 | IHC, ELISA, FCM, IF/ICC |
| 偶联标记 | AF647 |
| 宿主/亚型 | Goat / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 推荐稀释 | Flow Cyt 1/2000 - 1/4000 ab176103 - Mouse monoclonal IgG1 (Alexa Fluor® 647), is suitable for use as an isotype control to complement this secondary antibody.；ICC/IF 1/200 - 1/1000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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