外泌体标志物，TSG101 跑在第几条

Anti-TSG101 [EPR7130(B)]，WB 1/1000 起

超离收外泌体，裂解之后跑胶，想在同一张膜上同时看 CD63、CD81 和 TSG101。

转完膜剪条，TSG101 那一格孵完，显出来三条带，最上面那条很浅，中间那条最亮。

分不清哪条是目的蛋白的时候，先回到产品页看分子量。

图 1　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

这个蛋白在什么位置

TSG101 是 ESCRT-I 复合物的一个组分，负责把泛素化的膜蛋白分选进多囊泡体。

它在胞质里有 pool，也有一部分挂在内体膜上。外泌体形成的时候被一起包进去，所以在囊泡组分里能检测到。

这也解释了为什么细胞裂解液里的 TSG101 条带常常比外泌体里的粗。想说明外泌体纯度，靠的是标志物富集和阴性标志物缺失两个方向，不是单看一条带。

这支抗体的四道门

ab125011 是 EPR7130(B) 克隆，兔重组单克隆，IgG 亚型，覆盖人、小鼠、大鼠。产品页标的分子量是 44 千道尔顿，剪条就按这个位置来。

纯化方式是 protein A 亲和纯化，液体剂型，缓冲液里含 40% 甘油。加样的时候粘度偏高，枪头要慢吸慢放。

验证应用四个，稀释比分开给：WB 1/1000 到 1/10000，IHC-P 1/300 配 Tris/EDTA pH 9.0 热修复，ICC/IF 1 微克每毫升，流式胞内 1/20。

ICC/IF 那一档标注了具体条件：HeLa 细胞用 100% 甲醇固定 5 分钟。甲醇沉淀蛋白，膜通透性更好，但细胞形态会缩一点，拍图时注意标尺。

外泌体样品的三个对照

阳性标志物至少两个，TSG101 加 CD63 或 CD81，单看一个不足以说明问题。剪条之前先用预染标志物对一遍位置，尤其是分子量相近的几条带。

阴性标志物要有，常用内质网蛋白做对照，它不该出现在囊泡组分里。

总蛋白量要对齐。超离收的样品蛋白浓度往往很低，上样量不足时所有条带都浅，容易被误读成标志物缺失。量不够时可以浓缩一次，不要靠延长曝光凑亮度。超离之后重悬的体积也要记，两次收样体积不同，上样量就没法对齐。

三条操作建议

WB 从 1/1000 起，这支抗体上限到 1/10000，梯度可以拉开做，省抗体。

含甘油的缓冲液取样前轻弹混匀，甘油沉在管底，直接吸会造成浓度不均。

流式胞内染色用 1/20，同型对照选 ab172730，按同浓度配。

下一张膜，TSG101 按 44 千道尔顿剪条，位置先对，再谈定量。

关键参数

图 2　免疫组化 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

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