没处理过的细胞，MMP9 本来就没信号

MMP9 兔单抗，1/1000 到 1/20000

未刺激的 THP-1 裂解液跑 MMP9，1/1000 空的。学生加到 1/200，还是空的。怀疑抗体有问题。

翻说明书，厂家自己写了一行，未处理的细胞系在 1/200 时检测不到或者只有弱带，建议先用能上调 MMP9 表达的处理。

这句话把问题说清楚了。不是抗体不行，是样本里本来就没有。

图 1　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

分泌蛋白在哪儿

MMP9 也叫明胶酶 B，是分泌型的。合成之后走分泌途径出去，细胞裂解液里留下的是前体和少量胞内库存。

要看它的表达或者活性，上清比裂解液更有价值。收上清之前先换无血清培养基，饿十二到二十四小时，把血清里的蛋白酶背景降下来。

上清里的浓度低，需要浓缩。超滤管选截留分子量合适的，离心条件按管子说明走。

浓缩倍数要记下来。上样的时候按原体积折算，否则处理组和对照组的上样量对不上，比值全乱。

这支的事实

克隆号 EP1254，兔单抗，IgG。反应种属写了人、大鼠两个。

应用四项，WB、IHC、FCM、IF/ICC。IHC-P 1/1000，未纯化用 1/100 到 1/250，需要热修复。ICC/IF 1/250 到 1/500。

流式做胞内染色 1/1000，同型对照给的是 ab172730，兔单抗 IgG。

WB 的范围是 1/1000 到 1/20000，跨了一个数量级还多。这个跨度对应的是样本里靶蛋白丰度的差异，不是让随便挑一个用。

明胶酶原的带

MMP9 以酶原形式分泌，跑胶时常看到一条位置稍高的带，那是没被切掉前肽的形式。

激活之后前肽被切掉，位置低一截。两条带的相对深浅，反映的是激活的比例。

样本处理不当会假性激活。反复冻融、剧烈涡旋都能让前肽掉下来，看着像处理起了作用。

建议

刺激方案比抗体浓度更重要。诱导单核细胞贴壁，再加炎症因子，MMP9 的转录才会起来。不诱导，加到 1/50 也没用。

IHC 做肿瘤组织，先看间质和炎症细胞密集的区域。MMP9 主要由巨噬细胞和中性粒细胞分泌，肿瘤实质细胞里的信号往往弱。

流式用 1/1000，做胞内染色要先固定再透化，同型对照一管不能省。

明胶酶谱是另一条路。把明胶掺进胶里，跑完洗掉 SDS，孵育过夜，酶活的地方会出现透明的带。WB 看的是蛋白量，酶谱看的是活性，两个数不一定同向。

上清收下来先低速离心去掉细胞碎片，再浓缩。碎片里的胞内酶原会一起进来，把没激活的样本测成激活的。

下次跑 MMP9，把上清和裂解液并排上样。哪一管出带，后面就只收那一管。

关键参数

图 2　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

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