核里的 cyclin D1，靠大稀释比
cyclin D1 兔单抗，WB 到 1/50000
用重组蛋白做 WB，cyclin D1 在 1/50000 出带，很干净。换 cyclin D2，同样的稀释什么都没有。学生说抗体坏了，要换一支。
翻到说明书里的一行，写的是与 cyclin D2 重组蛋白相比，需要五十倍的抗体浓度才能达到同样的工作浓度。
不是不认，是认得很弱。五十倍这个数，正好说明交叉反应存在但门槛高。
为什么是五十倍
EPR2241 的免疫原在 C 端。cyclin D 家族的 C 端比 N 端保守，同源性高一些，但序列表位仍有差异。
抗体结合靠的是几个关键残基。差一个，亲和力就掉一个数量级。
用 1/50000 的浓度去试 D2，等于把本来就很弱的结合再稀释五万倍，自然什么也看不到。
把稀释提到 1/1000 再跑一次 D2，能看到一条淡带。这条淡带就是那五十倍的实际含义，看得见，但定量没法用。
这支的事实
克隆号 EPR2241，表位标的是 C 端。兔单抗，IgG。反应种属人、小鼠、大鼠。
应用四项，WB、IHC、IF/ICC、IP。IHC-P 1/100 到 1/500，需要热修复。ICC/IF 1/50。IP 1/30。
WB 的稀释范围是 1/10000 到 1/50000。这个区间很高，配液不能按常规的量吸。
ICC/IF 用 1/50，和 WB 差三个数量级。同一支抗体在两种实验里的用量完全不是一回事，稀释表要分两行写。
高稀释比怎么配
1/50000 等于一微升抗体配五十毫升。直接往大体积里加，移液误差大。
先配中间稀释液。取一微升加到一个毫升缓冲液里，混匀，再从这一管取一微升加到另一毫升里，两步走。
缓冲液里加 0.1% 的载体蛋白或者 1% BSA。这么低的抗体浓度，管壁吸附会吃掉相当一部分。
用低吸附管。普通离心管的聚丙烯表面对蛋白有亲和，稀释到五万倍时这个损失不可忽略。
建议
做家族成员的特异性验证，配一管同家族的其他重组蛋白并排跑。看到弱带不算失败，量出倍数才有意义。
IHC 的 1/100 到 1/500 和 WB 差两个数量级。组织里靶蛋白丰度低，不能照 WB 的数配。
IP 用 1/30，这个比例偏高，珠子要先封闭，否则非特异结合会很明显。
判读 IHC 时看核。cyclin D1 在 G1 期进核，阳性细胞的比例随细胞周期变，同一张片子上本来就不均匀。
下次做重组蛋白定量，先把同家族成员的交叉倍数查清楚，再决定用哪个稀释点。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | CCND1 |
| 验证应用 | WB, IHC, IF/ICC, IP |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/100 - 1/500 Perform heat-mediated antigen retrieval before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/10000 - 1/50000 Compared to the working concentration with cyclin D1 recombinant protein, a 50 fold increase is required with cyclin D2 recombinant protein in western blot testing.；ICC/IF 1/50；IP 1/30 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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