内质网应激的带，位置比深浅重要

GRP78 兔多抗，四个种属，三项应用

内质网应激诱导六个小时，WB 上 GRP78 的带比对照深了，位置也往上抬了一点。学生问是不是磷酸化。

GRP78 也叫 BiP，是内质网腔里的分子伴侣，帮新生蛋白折叠，也负责在应激时把未折叠蛋白反应拉起来。

它不是磷酸化蛋白。位置抬高常见的原因是样本处理，煮沸时间长了会形成聚集体，跑出来偏高。

图 1　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

应激时它为什么升

内质网的折叠负荷一上来，BiP 就从三个感受器上解离，去结合未折叠的蛋白。解离之后感受器被激活，下游的转录程序启动。

BiP 自己的转录也跟着上调。诱导之后总蛋白量是升的，WB 上带变深是预期结果。

带变深这个现象，不同细胞系差别大。上皮细胞反应强，某些悬浮细胞几乎不动。

时间点也影响判读。诱导两小时和六小时看到的深浅不一样，早期升得快，后期可能已经回落。取样时间要写进记录，不然两次实验没法比。

这支的事实

兔多克隆，IgG，未标记。反应种属四个，人、小鼠、大鼠、仓鼠。

应用三项，WB、IHC、IF/ICC。产品页没有给固定稀释比。

多抗识别多个表位，对不同变性条件的耐受性比单抗好。代价是批间差异，换批要重新定浓度。

四个种属里含仓鼠，做中国仓鼠卵巢细胞的工艺研究用得上。这类样本的抗体选择本来就少。

多抗的识别谱要自己摸

WB 上除了目标带，常能看到一两条弱带。有些是 BiP 的降解片段，有些是其他热激蛋白家族的交叉。

IHC 的最适浓度和 WB 不通用。组织里 BiP 在分泌活跃的细胞中表达量很高，胰腺、肝、浆细胞都是，背景容易上去。

做双标时要确认二抗不交叉。这支是兔源，另一个一抗别也用兔。

建议

样本煮沸五分钟就够。BiP 容易聚集，时间长了上样孔里能看到一团滞留。

WB 从 1/1000 起试，IHC 从 1/200 起试，两个数分开记在本子上。

判读 IHC 时先看胞质。BiP 在内质网腔里，信号该是核周的网状，不是核内。

遇到带位置整体偏移，先在同一块胶上跑一个未处理的对照。两边一起偏，是胶或者缓冲液的问题。

做药物处理的内质网应激模型，阳性对照用毒胡萝卜素或者衣霉素，两小时就能看到带变深。没有阳性对照，单看处理组的深浅说明不了什么。胶浓度按目标带的位置选，10% 左右够用，浓度太高，带挤在一起，和旁边的非特异带分不开。

下次看到带位置上抬，先缩短煮沸时间重跑一次，再考虑别的原因。

关键参数

图 2　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

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