微血管计数，先降背景
CD34 兔单抗，IHC-P 1/2500 到 1/5000
微血管密度计数，1/250 的稀释染出来背景一片浅棕，管腔的轮廓数不清。学生换到 1/1000，背景淡了，小血管也没了。
CD34 在血管内皮上表达，也在部分间质细胞和炎症细胞上。背景一高，真正的管腔就被淹了。
稀释不是唯一变量。修复方式和显色时间都会影响背景。
计数要的是轮廓
计数的对象是有管腔的血管，或者单个的内皮细胞。染成一片的都不算。
背景高的时候，阳性细胞之间的空隙被填满，管腔的边界消失，计数就没法做。
先降背景，再谈信号。顺序反了，越调越糊。
还有一种情况。肿瘤组织里的微血管形态不规则，管腔窄，靠 1/2500 染出来才分得开。浓度一高，相邻的管子就粘成一团。
这支的事实
克隆号 EP373Y，兔单抗，IgG。反应种属人、小鼠、大鼠。
应用五项加 IP，WB、IHC、FCM、IF/ICC、IP。IHC-P 1/2500 到 1/5000，柠檬酸 pH 6 热修复。
ICC/IF 1/100 到 1/250。WB 1/1000。流式胞内 0.2 到 1 µg/mL。IP 1/30。
流式那一栏的单位
0.2 到 1 µg/mL 是浓度。按每管一百微升算，一管用 0.02 到 0.1 微克。
按稀释比记的人，遇到浓度标注就会配错。一支 0.5 mg/mL 的抗体，配 1 µg/mL 等于稀释五百倍。
换算写在管子上，比记在脑子里稳。
流式做表面标记时，CD34 在干细胞的表达量低，取 1 µg/mL；在内皮细胞系上丰度高，取 0.2 µg/mL 就够。
建议
IHC 从 1/2500 起试，比 1/250 干净得多。这支的效价高，浓了只会出背景。
修复用柠檬酸 pH 6，微波加热。修复不足时内皮信号弱，修复过度时间质背景上来。
显色时间控制住。镜下看到管腔轮廓就终止，多等一分钟背景就压过信号。
拍照时固定曝光和白平衡。同一批片子的图要一起处理，单独调一张，阈值就不统一了。
CD34 在造血干细胞上也表达，做骨髓切片时别把造血细胞算成血管，形态上要看到管腔。微血管密度按单位面积算，视野面积必须一致，不同物镜拍的图不能混着数。双标加一个基底膜标记，管腔的边界更清楚。拍照时曝光定好就别再动，后期拉亮度会把弱信号提上来，阈值跟着漂。
下次计数，先在低倍下选三个热点区，再推到二十倍。热点区的选择标准要提前写好，不能边数边挑。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | CD34 |
| 验证应用 | WB, IHC, FCM, IF/ICC, IP |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/2500 - 1/5000 Perform heat-mediated antigen retrieval with citrate buffer pH 6 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/1000；ICC/IF 1/100 - 1/250；Flow Cyt (Intra) 0.2-1 µg/mL |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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| 品牌 | 货号 | 品名 |
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| BD Pharmingen | 555822 | ™ PE Mouse Anti-Human CD34 |
| Abcam | Ab6721 | Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) |
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