BrdU 染不上，多半是变性没做到位
Anti-BrdU [BU1/75]，大鼠单抗，IHC 1-3 µg/mL
片子脱蜡到水，抗原修复，血清封闭，一抗四度过夜。第二天显色，几乎看不到核染。
你换了新的一抗，又换了一批二抗，还是白板。
BrdU 不是普通的核抗原。它埋在 DNA 双链里，抗体进不去。
抗体为什么看不见
BrdU 是胸苷的类似物，掺进新合成的 DNA 里。它和基因组 DNA 结合得很紧，双链不解开，抗体识别的表位就露不出来。
所以 BrdU 染色的关键不在抗体，在变性。盐酸、甲酸或者 DNase I，目的都是把双链打开。
变性不足，片子干净得像没加过抗体。变性过头，DNA 被打碎，核形态散掉，背景反而升上来。
这两个失败的样子不一样。前者是空白，后者是脏片子，看片的时候就能分开。
还有一种情况是染色很淡，核能看见但发灰。这时候不是变性不够，是抗体浓度低，或者显色时间短，加长显色就能分辨。
BU1/75 这支克隆
Ab6326 用的是 BU1/75 克隆，也叫 ICR1，大鼠单克隆，IgG2a 亚型。
验证应用是 IHC-P、流式胞内染色和 ICC/IF。
IHC-P 的用量给的是 1 到 3 微克每毫升，需要柠檬酸缓冲液 pH 6 热修复。ICC/IF 是 1/250。流式胞内 1/25 到 1/200，同型对照推荐 ab18450。
注意宿主是大鼠。二抗要选抗大鼠的，别拿抗小鼠的二抗去配。这一步出错的比想象中多，而且错得很安静，片子就是白的。
变性的具体做法
石蜡切片常用 2 M 盐酸，37 度处理 30 分钟，之后用硼酸缓冲液中和。
中和这一步不能省。酸残留会影响后面抗体结合，也影响显色，片子会出现斑驳的底色。
ICC/IF 可以直接用 DNase I 处理，条件温和一些，核形态保留得好。
DNase I 的批号差异大，酶活不一样，用量按说明书重新算，不要照搬上一批的体积。
流式做 BrdU，变性在管子里做。离心速度不要太高，细胞容易碎，碎片一多，前向散射的图就散了。
染色前先用 70% 乙醇固定，负二十度放半小时。膜的通透性上去，抗体才进得去。
判读上的事
BrdU 阳性是核染，胞浆着色不算。
计数时至少数五个高倍视野，每个视野两百个细胞以上，不同处理组由同一个人读片。
增殖指数低到 5% 以下的样本，IHC 的判读误差很大，改用流式会更稳。
做双标的时候要留意。变性那一步会把另一个核表位一起破坏，两个标记最好分开染，或者把增殖标记换成 EdU。
下次染不出来，先补一步 2 M 盐酸 37 度 30 分钟，再看片子。
关键参数
| 抗原名称 | BrdU |
| 验证应用 | IHC, FCM, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Rat / IgG2a |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein G |
| 推荐稀释 | IHC-P 1-3 µg/mL Perform heat-mediated antigen retrieval with citrate buffer pH 6 before commencing with IHC staining protocol.；ICC/IF 1/250；Flow Cyt (Intra) 1/25 - 1/200 Rat IgG2a, kappa monoclonal [RTK2758] (Low endotoxin, Azide Free) ( ab18450 ), is suitable for use as an isotype control with this antibody. |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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| 品牌 | 货号 | 品名 |
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| BD Pharmingen | 555627 | ™ Purified Mouse Anti- BrdU |
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