超声打完，H3K4me3 才刚开始
Anti-Histone H3 tri methyl K4 多抗
交联、裂解、超声。取 5 微升跑胶看看片段大小，条带糊在 1 kb 上方。
你觉得差不多，继续往下做。跑完 qPCR，富集倍数只有对照的 1.3 倍。
片段大小决定了 ChIP 的上限
H3K4me3 标记在活跃基因的启动子上，覆盖范围通常只有几百个碱基。超声打不断，抗体拉下来的就是一大段染色质，目标区域被稀释在里面。
判断标准很土但有效。琼脂糖胶上主带落在 200 到 500 bp，没有明显的大分子拖尾，再往下走。
打过头也不行。片段小于 100 bp 时核小体结构散了，抗体识别的表位跟着受影响。
同一个超声条件，不同细胞系的结果不一样。悬浮细胞比贴壁细胞难打，冻存的细胞核更脆，参数得重新摸。
超声的功率和间隙也要写进实验记录。连续超声会让样本升温，蛋白和 DNA 一起降解。间歇式的探头，开十秒停十秒，样本全程放在冰浴里。
这支多抗的定位
Ab8580 是兔多克隆，识别人和牛的组蛋白 H3 三甲基化 K4。
验证应用给得很全，WB、IHC-P、ICC/IF、ChIP 和肽段阵列。
ChIP Grade 这个标注，代表厂家做过 ChIP 验证，不代表每个细胞系都适用。换一个物种、换一种交联方式，条件都要自己重新摸。
多克隆的好处是识别多个表位，拉下来的片段覆盖更宽。代价是批次之间有差异，同一个课题尽量用同一批号做到结束。
做对照的时候，同型对照的用量要和一抗对齐，不是随手加 1 微升。抗体量差一倍，非特异结合差得更多。
阴性对照怎么设
ChIP 的对照不是随便找个基因。H3K4me3 富集在启动子，阴性区要选一个已知没有这个修饰的异染色质区域，或者基因间区。
另一个对照是 IgG，同种属同剂量，用来扣掉非特异结合。
还有一个容易被忽略的，输入样本。没有 input 就没法算富集倍数，也判断不了超声效率。
三个对照缺一个，数据都很难解释。审稿人问起来，卡住的往往不是抗体，是这一步。
操作建议
每次超声后都留 5 微升做片段检查，不要凭经验省这一步。
抗体量按细胞数给，不要按体积给。细胞数变了抗体不变，富集倍数会跟着飘。
qPCR 引物设计在转录起始位点上游 500 bp 以内，H3K4me3 的峰就在那附近。引物放到基因体里，信号会平掉。
下一次做 ChIP，先花半天把超声条件摸到 200 到 500 bp，再谈抗体。
关键参数
| 反应种属 | Human, Bovine |
| 抗原名称 | H3C1 tri methyl K4 |
| 验证应用 | WB, IHC, IF/ICC, ChIP, Peptide Array |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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