p65 进核没有，看总蛋白是看不出来的
Anti-NF-kB p65，兔多抗，人和小鼠
LPS 刺激 30 分钟，收蛋白，跑 p65 的 WB。
条带和未刺激组几乎一样深。
你觉得通路没激活。可 ICC 的片子上，p65 已经从胞浆跑到核里了。
总量和定位是两件事
NF-κB 的激活靠的是核转位，不是蛋白量的增加。
静息状态下 p65 和抑制蛋白结合，留在胞浆。刺激之后抑制蛋白被降解，p65 游离出来进核。
整个过程里，p65 的总量基本不变。WB 测总量，看不到这个变化。
有人会去看磷酸化的 p65，那个指标反映的是另一层调控。
要看激活，得做核质分离，或者做 ICC 看它和核染料是不是共定位。
核质分离的两个组分要同时跑，只看核组分说明不了问题。
核组分蛋白量少，上样前先定量，别按体积上。
这支抗体的参数
Ab16502 是兔多克隆，靶点 Rela，反应种属写的是人、小鼠。
验证应用是 WB、IHC-P、ICC/IF 和 IP。
产品页没有给固定稀释比，各个系统自己摸。
多克隆识别 p65 的多个表位。做 IP 的时候，拉下来的效率通常比单克隆高一些，代价是背景也要多洗两遍。
做 IP 时把 IgG 重链的位置标出来，别和 p65 混在一起。
p65 和重链分子量接近的时候，换一种检测方式。
核转位的判读
ICC 做 p65，细胞固定后破膜，一抗孵育，二抗带荧光，同时用 DAPI 或者 Hoechst 染核。
判读看的是胞核里的荧光强度是不是高过胞浆，不是看整体亮不亮。
至少数两百个细胞，按核强于胞浆、核胞浆相当、胞浆强于核三档分类。
拍片时曝光参数统一，不同片子之间的荧光强度才可比。
每换一批片子，先拍一张标准片校准一次。
只报平均荧光强度，不报定位，等于没做。
时间点和对照
p65 的核转位很快。刺激后 15 到 30 分钟是高峰，两小时可能已经回落。
做时间梯度，15、30、60、120 分钟各收一次。
阳性对照用 TNF-α 或者 LPS，阴性对照用未刺激的细胞。
两种刺激的动力学不一样，别混着比。
加一组通路抑制剂，核转位应该被压住。这一组能把非特异的核染色排掉。
抑制组没有变化，先查抑制剂活性，再怀疑抗体。
抑制剂的预处理时间要够。加得太晚，核转位已经发生完了。
预处理通常要一小时以上，具体看抑制剂作用在哪一步，加之前先确认溶解度。
下一次做 p65，WB 和 ICC 一起做，核质分离那两管同时跑，别只看总蛋白。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse |
| 抗原名称 | Rela |
| 验证应用 | WB, IHC, IF/ICC, IP |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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| 品牌 | 货号 | 品名 |
|---|---|---|
| Abcam | AB16502 | Anti-NF-kB p65 antibody 本文产品 |
| abclonal | A19653 | [KO Validated] NF-kB p65/RelA Rabbit mAb |
| abclonal | A2547 | NF-kB p65/RelA Rabbit pAb |
| Abcam | Ab32536 | Anti-NF-kB p65 antibody [E379] |
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