β-tubulin 当内参，先把上样量对齐

Anti-beta Tubulin，兔多抗，四个种属通用

六块胶连着跑，每块都放了 β-tubulin，曝光之后六个条带深浅差了一倍多。

第一反应是抗体批间差，翻出上一支的旧货对比，结果差不多。

问题出在裂解液和上样量上，不在抗体。

图 1　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

内参条带的深浅是谁定的

β-tubulin 是微管的主要成分，在所有真核细胞里都表达，序列保守，做内参的条件基本都满足。

但它的量不是天生恒定的。细胞周期不同、贴壁状态不同、给药之后微管的聚合与解聚比例变了，可溶部分和沉淀部分的分配就跟着变。

裂解这一步最容易出岔子。RIPA 里 NP-40 浓度不够，微管留在沉淀里，上清中的 tubulin 就偏少，内参条带浅下去，目的蛋白反而显得强。

低温操作也会改结果。冰上放太久，微管解聚，上清里的量往上走。

这支抗体的适用范围

AB6046 是兔多克隆，IgG 亚型，识别人、小鼠、大鼠、仓鼠四个种属的 β-tubulin。

验证过的应用四个：WB、IHC-P、ICC/IF 和 IP。一支抗体横跨四个系统，要做多平台互相印证的课题比较省事。

免疫原用的是全长蛋白还是片段，产品页没有细说。多抗的好处是识别多个表位，容忍一定程度的构象变化；代价是批间差异要靠每批的 QC 数据来兜。

产品页标的分子量是 50 千道尔顿。跑胶的时候条带就落在这个位置附近。tubulin 会被乙酰化和酪氨酸化修饰，条带偶尔上移一点，先看同批样本是不是都移，再决定要不要怀疑抗体。

货号写的是 AB6046，大写。下单和查资料都按这个写法，别跟小写的 ab 系列混。

上样量这件事值得单独立规矩

每孔总蛋白定量到同一个数，BCA 或 Bradford 都行，但同一批实验只能用一种方法。

定量之后再看一眼胶。考马斯亮蓝染一块平行的胶，比只看内参更早发现问题。

冻存过的样品复溶之后再测一次浓度。反复冻融会让蛋白降解，内参变浅的同时目的蛋白也浅，这种情况换抗体解决不了。

如果某几个泳道内参特别浅，先怀疑上样，不要直接归因到处理组。把同一批样品重跑一遍，换一块新胶，成本比重新做实验低得多。

三条操作建议

裂解液里补足去垢剂，超声两三秒打断 DNA，离心取上清，不要图省事直接煮沸全裂解物。

转膜之后先染丽春红，看一眼总蛋白转移是否均匀，再决定要不要调上样量。这一步花五分钟。

一抗和二抗的浓度产品页没有给固定稀释比，按实验室已验证的条件走，一次只改一个参数。

下一次跑胶，六个泳道先各上 15 微克，染完丽春红再决定第二批要不要动。

关键参数

图 2　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

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参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。