Caspase-3 只有 WB，别染片

Anti-Caspase-3 多抗，人样本，敲除验证过

实验记录本上写着：Caspase-3 一抗 1/500，切片四度过夜。

第二天显色，切片干干净净，一点棕色都没有。

翻了产品页，验证应用那一栏只有一个词：WB。

图 1　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

验证到哪一步，就只能用到哪一步

抗体说明书上的应用列表不是推荐，是厂家做过的验证范围。

WB 验证过，说明这支抗体在变性、还原的条件下能认出目的蛋白。切片染色是另一套条件，抗原有构象，还要过修复这一关。

多抗因为识别多个表位，在未验证的应用上有时也能出结果，但那个结果没有依据，出了也说不清是特异还是背景。

要做组织切片，找一支标了 IHC 的抗体，比在一支只做 WB 的抗体上碰运气划算。

这支抗体的数据

ab13847 是兔多克隆，IgG 亚型，靶点是人的 CASP3，种属只写人。

验证应用一个：WB。产品页没有给稀释比，按实验室已验证的条件走。

一个值得注意的点是特异性的验证方式：厂家用敲除样本做了确认。这比只跑一条细胞系裂解液要严格，敲除之后条带消失，说明抗体认的确实是这个蛋白，不是旁边分子量相近的东西。

产品页标的分子量是 17 千道尔顿，这个数字对应的是剪切后的片段，跟酶原的位置差得比较远。

纯化方式是免疫原亲和纯化，缓冲液里含 1% BSA 和 0.02% 叠氮钠。这两样在常规 WB 上没影响，做偶联时要换液。

条带怎么读

Caspase-3 以酶原形式存在，激活之后被剪切成片段。WB 上常见的是上方一条前体带和下方一条或两条剪切带。

判断凋亡，看的是剪切带有没有出现、比例有没有上升，不是看总条带变深变浅。总蛋白量掉下来，可能只是细胞死了。

上样量要一致。凋亡晚期细胞会脱落，收细胞的时候把上清一起离心收回来，否则蛋白量对不上。转膜也要检查，大分子和小分子的转移效率不同，剪切带转过去了，前体不一定过去。

剪切的判读用比值不用绝对值，剪切带除以总条带，同一张膜内部就能比。

三条操作建议

切片实验换一支标了 IHC 的抗体，不要在这支上继续调条件。

WB 的阳性对照用凋亡诱导过的细胞，阴性对照用未处理的同批细胞，两条一起跑。诱导时间不要只取一个点，四小时和八小时差别很大。

缓冲液含叠氮钠，做偶联之前先换液，叠氮会干扰部分标记反应。

下一批样品，先跑一对抗体和阴性对照，看剪切带有没有分开。

关键参数

图 2　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

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参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。