磷酸化抗体，封闭液先换掉
Anti-AKT (pT308)，兔多抗，裂解要加抑制剂
处理组和对照组的膜，p-AKT 那条带位置对，但两组的深浅几乎一样。
上样量查过，内参齐。曝光时间从 30 秒拉到 5 分钟，两组一起变深，比值没动。
他用的封闭液是 5% 脱脂奶，一直这样。
磷酸化抗体的坑，多半不在抗体上。
牛奶里全是磷酸蛋白
脱脂奶的主要成分是酪蛋白，酪蛋白本身就是高度磷酸化的蛋白。
封闭的时候，这些磷酸蛋白会占住膜上的蛋白结合位点，同时也给抗磷酸化抗体提供了一堆可以贴的地方，背景就抬起来了。
换成 5% BSA，成分里没有磷酸蛋白，这一层干扰就没有了。
同一张膜，一半用奶一半用 BSA，第二天看背景差多少，一次就能定下来。
裂解液里的抑制剂不能省
磷酸化和去磷酸化在裂解的那一刻还在进行。裂解液里不加磷酸酶抑制剂，提取过程中磷酸基团就掉了。
常用的组合是氟化钠加原钒酸钠，配好分装冻在负二十，用之前现加。
原钒酸钠要活化之后才有抑制作用，直接称量溶解的效力不稳定，这一步很多人省掉了。
裂解全程在冰上，超声或研磨完立刻离心，不要把样品放在室温等着排队。
这支抗体的适用范围
靶点是 AKT1 的 T308 位点，反应种属写的是人、小鼠、大鼠。
宿主是兔，多克隆，验证系统是 WB 和 IHC-P。
稀释比这一栏没有给固定值，只能自己摸。摸的时候从上样量入手，40 µg 一孔，抗体做 1/500、1/1000、1/2000 三个点。
IHC-P 上 p-AKT 的阳性在胞质和膜，强度普遍偏弱，正常组织里几乎看不到，别拿正常组织当阳性对照。
切片上的磷酸化信号对缺血时间很敏感。取材后拖上十几分钟再固定，阳性就掉一半，这一步比抗体浓度更值得盯。
判读要看比值不看亮度
p-AKT 的变化常常是两三倍，肉眼在膜上分不出来。
同一张膜先跑 p-AKT，剥膜之后跑总 AKT，两个信号相除，才是一个可比的数。
剥膜这一步对磷酸化抗原有损耗，第二次显影的信号会弱一些。更稳的做法是同一批裂解液跑两张胶，一张磷酸化一张总蛋白。
曝光不要曝到饱和，饱和之后灰度值封顶，比值就失真了。
内参也要在同一张膜上跑。β-actin 和 p-AKT 的分子量差得不远，切膜的时候留够余量。
明天做三件事：封闭液换 BSA，裂解液加氟化钠和活化过的原钒酸钠，同一批样本跑两张膜，p-AKT 和总 AKT 各一张。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | AKT1 pT308 |
| 验证应用 | WB, IHC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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