一支 CD3，四套稀释条件

Anti-CD3 [SP7]，兔单抗，四套系统四个条件

肿瘤浸润淋巴细胞的片子，CD3 该在最靠近肿瘤巢的边缘围一圈。

第一轮染色，圈是出来了，但肿瘤实质里也散着一片棕色，跟背景混在一起。

同学把一抗从 1/150 降到 1/500，边缘那圈也没了。

他把这支抗体的条件当成一个数在用。

产品页给了四组条件

这支抗体的验证系统是 WB、IHC-P、mIHC 和流式胞内，每组条件单独写。

IHC-P 1/150，切片在 pH 6.0 的柠檬酸缓冲液里煮 10 分钟，室温冷却 20 分钟。

mIHC 1/100 到 1/2000，修复换成 Tris/EDTA pH 9.0。

WB 1/25 到 1/1000，跨度四十倍。

流式胞内 1/100，二抗推荐 Alexa Fluor 488 标记的羊抗兔。

宽区间不是随手挑

mIHC 的 1/100 到 1/2000，跨度这么大，是因为多重染色里每一轮的信号要叠加。

酪胺信号放大之后，一抗可以给得很稀，稀一点能减少轮与轮之间的串色。第一轮先按 1/2000 试，信号弱再往浓的方向走。

WB 的 1/25 是全表最浓的一档。组织裂解液里 T 细胞占比低，CD3 的总量本身就少，浓一点才看得见带。

别把 WB 的 1/25 拿去做切片，那是两个数量级的事。

修复液要和稀释比配对

IHC-P 用柠檬酸 pH 6，mIHC 用 Tris/EDTA pH 9.0。两种修复液揭开的表位不完全一样。

稀释比和修复条件是配对给的。换了修复液，稀释比要跟着重新摸，不要只改一个。

煮的时间和冷却的速度都影响结果。煮完直接冲冷水，组织容易脱片；室温慢慢冷 20 分钟，形态和染色都稳。

切片脱片的话，先查烤片温度和时间，别先怀疑抗体。

柠檬酸修复偏温和，适合膜表面和胞质里的表位；核内和部分膜蛋白的表位要靠 EDTA 才揭得开。CD3 的胞内段两种都能做，选哪个看同批其他抗体怎么配。

同型对照和二抗

流式那一栏点名了两个配套，ab172730 是兔单抗 IgG 同型对照，ab150077 是 Alexa Fluor 488 的羊抗兔二抗。

同型对照的用量和一抗一致，浓度不一致的对照没有意义。

多重染色里，二抗的宿主要和上一轮的抗体错开，否则第二轮的二抗会回头认第一轮的一抗。

每加一轮之前拍一张空白对照的图，串色是累积的，等到最后一轮才发现就白做了。

下一批片子，先按 1/150 配柠檬酸修复跑一张单标，确认边缘那圈干净了，再往多重上走。

关键参数

反应种属	Human, Mouse, Rat
抗原名称	CD3E
验证应用	WB, IHC, FCM, MIHC
宿主/亚型	Rabbit / IgG
抗体类型	Monoclonal
纯化方式	Affinity purification Protein A
推荐稀释	IHC-P 1/150 Boil tissue section in 10mM citrate buffer, pH 6.0 for 10 min followed by cooling at room temperature for 20 min. Perform heat-mediated antigen retrieval with citrate buffer pH 6 before commencing with IHC staining protocol.；mIHC 1/100 - 1/2000 Perform heat-mediated antigen retrieval with Tris/EDTA buffer pH 9.0 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/25 - 1/1000；Flow Cyt (Intra) 1/100 ab172730 - Rabbit monoclonal IgG, is suitable for use as an isotype control with this antibody. We recommend using Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor ® 488) ( ab150077 ) secondary antibody.
储存条件	短期 +4°C；长期 -20°C

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品牌	货号	品名
Abcam	Ab16669	Anti-CD3 epsilon antibody [SP7] 本文产品
BD Pharmingen	553061	™ FITC Hamster Anti-Mouse CD3e
BD Pharmingen	553066	™ APC Hamster Anti-Mouse CD3e
BD Pharmingen	563565	BD Horizon™ BUV395 Hamster Anti-Mouse CD3e

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