MMP9 只有 WB，也够用

Anti-MMP9，兔多抗，只写小鼠、只写 WB，100 µg 装

细胞因子上清的 WB，MMP9 那条带在培养上清里几乎看不到。

同学换了三支抗体，都没做出来。

最后一支是这支，产品页上只写了 WB、只写了小鼠，看着条件很窄。

窄有窄的好处，条件写得死，反而不用猜。

窄的范围怎么用

反应种属只有小鼠，验证系统只有 WB。

做人的样本、做大鼠的样本，都不在这支的范围里。做 IHC 也不行，产品页没做这个验证。

范围窄，反而不必花时间试别的系统。要做组织定位，另找一支验证过 IHC 的。

这支的定位很清楚，就是小鼠样本的免疫印迹。

范围窄还有个附带好处，摸索条件的时间短。知道只有一个系统要优化，变量就只剩上样量和抗体浓度两个。

装量写的是 100 µg，按 WB 的常规用量算，够做一批实验。

分泌型蛋白的样本处理

MMP9 是分泌型的，主要以酶原形式释放到胞外。

细胞上清里的浓度低，直接上样看不出来。常用的做法是无血清或低血清培养 24 小时，收上清，超滤浓缩十倍以上。

上清里的血清蛋白会干扰，血清浓度降下来，背景也跟着降。

浓缩倍数要写清楚。十倍和二十倍的上样量不是一回事，换算的时候容易把组间的差异算错。

组织样本用裂解液提取，基质里的 MMP9 有一部分结合在细胞外基质上，裂解液的盐浓度要够。

反复冻融会让酶原自我活化，收完分装，一次一支。

酶谱和 WB 的分工

明胶酶谱看的是活性，MMP9 在含明胶的胶里跑，复性之后能降解底物，出现一条透亮的带。

WB 看的是蛋白量，不管有没有活性。

两个结果对不上的时候不奇怪。酶原多，活性低，说明活化那一步被卡住了。

课题里要讲活性，酶谱是必要的补充；要讲表达量，WB 就够了。

判读注意的两点

MMP9 在还原条件下跑，条带位置和天然状态不同，比较分子量的时候用非还原胶更接近。

糖基化会让条带偏宽，看到一条毛边的带不要以为是降解。

阳性对照用脂多糖刺激的巨噬细胞上清，这支在很多实验室里就是这么用的，信号稳。

诱导时间的长短直接决定上清里的量，24 小时和 48 小时能差出一截。

同一批实验的上清收样时间要统一，不然组间的差异分不清是处理造成的还是时间造成的。

上样前的蛋白定量要给上清单独做一次。细胞的裂解液定出来的浓度，不能拿来算上清。

明天先把培养方案改成无血清 24 小时，上清超滤浓缩十倍，一孔上样 30 µL，先跑一张看看带有没有。

关键参数

反应种属	Mouse
抗原名称	Mmp9
验证应用	WB
宿主/亚型	Rabbit / IgG
抗体类型	Polyclonal
纯化方式	Affinity purification Immunogen
储存条件	短期 +4°C；长期 -20°C

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