总 AKT 和 p-AKT，跑同一张膜
Anti-pan-AKT，兔多抗，WB、IHC-P、ICC/IF 三个系统
信号通路的实验，最常被问的一句是，总蛋白变没变。
同学的处理组 p-AKT 升了三倍，图很漂亮。补做总 AKT 之后，总蛋白也升了两倍多。
三倍除以两倍，剩下的那点差异，撑不起一个结论。
磷酸化的变化，得放在总量的背景里看。
为什么要配一支 pan-AKT
pan-AKT 认的是 AKT 的保守区，不区分磷酸化状态，三个亚型都能识别。
它的作用是把总量定下来。总量稳，磷酸化的升高才是信号通路的激活；总量也升，那可能只是表达量变了。
同一批裂解液，分成两份跑两张胶，一张 pan-AKT 一张 p-AKT，是最省事的做法。
剥膜重跑也可以，但磷酸化信号在剥膜之后会掉，两张胶更稳。
两张胶的胶浓度和转膜条件要一致，不然同一批样本在两个系统里的迁移对不上。
这支抗体的条件
靶点是 AKT1，pan 型，反应种属写的是人、小鼠和大鼠。
宿主兔，多克隆。验证系统是 WB、IHC-P、ICC/IF。
稀释比没有给固定值，只能自己定。WB 从上样 30 到 40 µg、抗体 1/1000 起手，摸三个点。
IHC-P 上 pan-AKT 的阳性在胞质，正常组织普遍有表达，强弱差别不大，做对照组织比较好找。
切片上的 pan-AKT 更适合看定位和丢失，不适合做定量。灰度受曝光和显色时间影响，跨批次比不了。
ICC/IF 看的是胞质弥散，细胞边缘的强度略高。
上样量要一致
pan-AKT 和 p-AKT 的比值，只有在同一上样量下才有意义。
测浓度用同一种方法，BCA 和 Bradford 的结果不能混着用。
上样前煮沸的时间也要统一，AKT 对热比较敏感，煮太久会聚。
胶的浓度按分子量选，AKT 在六十到六十几千道尔顿之间，百分之十的胶够用。
转膜用湿转，恒流两小时，PVDF 膜先用甲醇活化。这一步偷懒，大小两个亚型会分不开。
判读的顺序
先看 pan-AKT 的条带是不是齐。不齐就先解决上样，不要往下算。
齐了再看 p-AKT。两条带的形状要一致，位置要对得上。
比值算出来之后看趋势，不要逐个样本比小数。
如果处理组的 pan-AKT 也明显升高，就要回到处理本身，看是不是影响了转录或者降解，而不是把结论写成通路激活。
明天把同一批样本重跑一次，pan-AKT 和 p-AKT 各一张膜，上样量统一到 35 µg，两张膜同时曝光。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | AKT1 |
| 验证应用 | WB, IHC, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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