二抗稀释比，两个系统差十倍
山羊抗小鼠 IgG H&L，AF594 标记
免疫荧光的片子染得挺好，同一个样本拿去做流式，细胞群整个右移，阳性和阴性分不开。
一抗没换，样本没换。换的是二抗的用量。
同一支二抗，ICC 和流式的量不在一个量级
产品页给 ICC/IF 的稀释比是 1/200 到 1/1000，给流式是 1/2000 到 1/4000。
差十倍。原因在体系。贴在玻片上的细胞，二抗孵育液只有几十微升，浓度高一点才能覆盖；流式是悬在几百微升的缓冲液里，细胞数量固定，二抗靠浓度梯度扩散到细胞表面，浓度太高背景就压不住。
做流式的时候照搬 ICC 的比例，细胞表面会挂满二抗，同型对照也跟着抬高，两个群挤在一起。
H&L 认什么，AF594 在哪
产品名里的 H&L 是 heavy and light chains 的缩写，意思是这支二抗同时识别小鼠 IgG 的重链和轻链。
好处是通用，小鼠的 IgG1、IgG2a、IgG2b 各个亚型都能结合，做一抗筛选的时候不用每种亚型配一支二抗。
代价是做免疫沉淀后的检测时会看到重链和轻链的带。裂解液里本来就有的内源免疫球蛋白，也会被一起认上去。
做组织切片的时候，这一层干扰在血管周围和炎症浸润区最明显。
Alexa Fluor 594 的激发峰在 590 nm 附近，发射在 617 nm。
和 488 搭配做双标，两个通道的串色不算严重，但 488 的发射尾巴会拖到 594 的检测窗口里一点。补偿要调。
和 647 搭配更宽松。两个染料的发射峰隔得远，多色面板里同时用，通道之间基本不打架。
这个染料的光稳定性好，适合需要长时间曝光或者共聚焦扫描的样本。抗淬灭封片剂还是要加，曝光时间长了照样会漂白。
缓冲液里有甘油，避光这两条都要做到
配方是 PBS 加 23% 甘油、1% BSA 和 0.02% 叠氮钠。
甘油起防冻作用，负二十度存放不会结冰，稳定期十二个月。产品页另外写了两条，避光保存，避免冻融循环。
荧光染料对光敏感，取用的时候别把管子敞在操作台的灯下。分装成小份，用一管拿一管，减少开盖次数。
同型对照产品页点名了 ab178000，小鼠单抗 IgG1 带 AF594 标记，和这支配着用。
三条操作建议
流式从 1/2000 试起。细胞的背景压不住再往 1/4000 走，不要反过来从低稀释比往上试。
孵育全程避光，四度三十分钟。时间长了内吞会增加，表面信号变成胞内颗粒。
多色面板里先染丰度低的那个标记，AF594 放在后面。染料之间的补偿按单标管调，不要凭经验填数。
下次配二抗，把 1/2000 和 1/200 写在两个管子上，别混着用。
关键参数
| 反应种属 | Mouse |
| 抗原名称 | IGHG1 |
| 验证应用 | IHC, ELISA, FCM, IF/ICC |
| 偶联标记 | AF594 |
| 宿主/亚型 | Goat / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 推荐稀释 | ICC/IF 1/200 - 1/1000；Flow Cyt 1/2000 - 1/4000 ab178000 - Mouse monoclonal IgG1 (Alexa Fluor® 594), is suitable for use as an isotype control to complement this secondary antibody. |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。