同一支 CD68，三个系统差六十倍
Anti-CD68 [KP1]，IHC-P 用到 1/3000
肿瘤间质里想标巨噬细胞，切片按 1/500 染，整个间质都是棕的，连着肿瘤细胞也带上了一层。
换成 1/3000，同一批切片，同样的修复条件，背景干净了，阳性细胞看得清清楚楚。
三个稀释比，和前置的修复条件
产品页给的数是 IHC-P 1/3000，WB 1/1000，ICC/IF 1/50。
最高的和最低的差六十倍。这三个数不是笔误，是三个体系的实际用量。
IHC 的孵育液覆盖整张切片，抗体扩散的空间大，浓度可以很低。ICC/IF 是贴壁细胞，抗体要穿透到细胞质里，而且要对抗固定带来的遮蔽，浓度必须高。
拿 IHC 的比例去做 ICC，染出来是一片；拿 ICC 的比例去做 IHC，背景整个抬起来。
产品页在 IHC-P 那一栏后面跟了一句话，热修复用 Tris-EDTA 缓冲液，pH 9.0。
CD68 是一个溶酶体相关的糖蛋白，表位对固定和包埋都敏感。柠檬酸 pH 6.0 的修复强度不够，染色偏弱；Tris-EDTA 的高 pH 配合加热，能把交联打开得更彻底。
修复的时间和温度要固定。同一批实验里的切片，修复条件不一致，阳性率就没法比较。
KP1 这个克隆认的是人 CD68，反应种属只写了人。做小鼠的样本，这支不适用。
判断阳性看的是胞质颗粒
CD68 主要定位在溶酶体和内体上，染色呈现胞质里的颗粒状。
巨噬细胞的形态不规则，胞质铺得开，颗粒散布在里面。肿瘤细胞如果出现点状着色，先怀疑是吞噬或者非特异吸附，不要直接计入阳性。
计数的时候，一个细胞里有几颗明显的颗粒就算阳性，不要要求整个胞质都满。
三个系统各自要注意的地方
WB 用 1/1000。CD68 有多个糖基化形式，条带偏宽，位置在 110 kDa 上方一片。看的是有没有带，不是精确位置。
ICC/IF 用 1/50，浓度高，封闭要做足。固定后用 0.1% Triton 透化十分钟，否则颗粒信号出不来。
IHC-P 用 1/3000，一支能染很多张。配液的时候用两步稀释，先配 1/100 的中间液，再稀释到工作浓度。
三条操作建议
切片厚度控制在 4 µm。间质里的巨噬细胞分布散，厚切片叠在一起，计数会偏高。
封闭用含 5% 正常血清的缓冲液，室温三十分钟。这支浓度低，封闭不足的时候边缘会出现一圈假阳性。
判读避开坏死区。坏死灶周围的非特异吸附最强，那里的棕色不能算。
下次染肿瘤间质，先把 1/3000 和 pH 9.0 两条写在切片盒上。
关键参数
| 反应种属 | Human |
| 抗原名称 | CD68 |
| 验证应用 | WB, IHC, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Mouse / IgG1 |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/3000 Perform heat-mediated antigen retrieval with Tris/EDTA buffer pH 9.0 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/1000；ICC/IF 1/50 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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