LC3 两条带，胶得配 15%
Anti-LC3B 兔多抗，14 kDa
自噬诱导之后收样跑胶，十二个点的胶跑完，LC3 的位置只有一条粗带。学生说 LC3-II 升高了，自噬被激活。
问他怎么分的 I 和 II，他说两条带挨在一起，算成了一片。
两条带的差别是一个磷脂
LC3B 翻译出来是前体，加工后变成胞质的 LC3-I。
自噬启动的时候，LC3-I 的 C 端和磷脂酰乙醇胺共价连接，变成 LC3-II，插到自噬体的膜上。这一步是整个自噬通路里最靠后的标记性事件。
LC3-I 是胞质可溶的，LC3-II 是膜结合的。两者分子量只差一点，跑胶的时候靠得极近。
产品页标的分子量是 14 kDa。这个数对 15% 的胶是合适的位置，对 12% 的胶就太靠下了。
配胶和转膜决定能不能分开
胶的浓度先定。15% 的分离胶，丙烯酰胺和甲叉的比例调好，跑出来两条带之间能看出缝。
转膜用 0.22 µm 的膜。14 kDa 的蛋白在 0.45 µm 的膜上容易穿过去，尤其是湿转超过一小时的时候。
转膜液里加 20% 甲醇，不加 SDS。甲醇让蛋白更好地结合膜，SDS 多了反而促进穿透。
显影之后先看两条带的比例，不要看绝对强度。LC3-II 比 LC3-I 的比值，比单看 II 的量可靠。
自噬流判断与另外两个应用
自噬小体形成增多，II 会升。自噬小体降解受阻，II 也会升。两种情况的膜上一模一样。
要区分，加一组氯喹或者巴弗洛霉素 A1 阻断溶酶体降解。
阻断之后 II 继续升高，说明上游在正常运转，流是通的。阻断之后没变化，说明下游卡住了。
诱导剂和阻断剂要同批次的细胞，同一天收样。分开两天做，样本间的基线差异会盖过处理效应。
IHC-P 看的是胞质里的点状信号。自噬体在胞质里是散在的小颗粒，高倍下能数出来。核内的着色不算。
ICC/IF 用这支要配一个膜标记或者核标记，方便定位。自噬体的分布随营养状态变化，饥饿处理之后会往核周集中。
反应种属是人、小鼠、大鼠。产品页写明在人样本里做过验证，鼠源样本的阳性对照要自带。
三条操作建议
裂解液里加新鲜的蛋白酶抑制剂。LC3-II 在膜上，但整体蛋白量少，降解一点就很明显。
上样量按 20 到 30 µg 起。太少了看不到 II，太多了两条带糊成一片。
每一次跑胶都带一管诱导处理的阳性样本。LC3 的条带对实验条件敏感，同一批抗体在不同天跑出来的比例可能是两个数。
下次配胶之前，先把 15% 写进记录本，胶板和膜一起备齐。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | MAP1LC3B |
| 验证应用 | WB, IHC, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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