M2 巨噬细胞的棕色，落在膜上

CD163 兔单抗，IHC-P 1/500，四种应用

脾脏切片染 CD163，红髓那片棕色很足，学生看着挺满意。推到四十倍，棕色把巨噬细胞的整个胞体都铺满了，边缘找不到轮廓。翻记录，一抗写的是 1/200。

CD163 属于清道夫受体家族，站在单核细胞和巨噬细胞的膜上。它的活是识别结合了血红蛋白的触珠蛋白复合物，把游离的血红蛋白清走。信号该沿着胞膜走成一条线，胞质里空着。

胞质铺满，一般有两个原因。抗体浓度过高，非特异结合进了胞内；或者切片偏厚，两三个焦平面的信号叠在一起，看着就是一片。

膜上的受体，判读先找轮廓

CD163 在组织里的分布跟巨噬细胞的亚型有关。M2 端表达高，M1 端低，肿瘤间质里散在的那群细胞，往往比脾红髓里的弱一个量级。

同一张片子上的强弱差，不一定是染色不均。先看形态，再看强度。

轮廓清晰的细胞，就算颜色浅也算阳性。轮廓糊成一片的，颜色再深也不好判。

这支的事实

克隆号 EPR19518，兔单抗，IgG。反应种属写了人、小鼠、大鼠三个。

应用四项，WB、IHC、FCM、mIHC。IHC-P 的稀释是 1/500，前提是 Tris/EDTA pH 9.0 的热修复。冰冻切片 IHC-Fr 是 1/200，修复液换成 10 mM 柠檬酸 pH 6.0 加 0.05% Tween-20。WB 1/1000，流式 1/60 到 1/100。

两个 IHC 的稀释差了 2.5 倍，修复液也不一样。石蜡和冰冻不能套同一个数。

mIHC 那一栏跨度很大

多重免疫组化的推荐稀释写的是 1/300 到 1/8000，跨了二十多倍。

这个范围不是给同一种样本用的。多重染色里每个标记的丰度差着数量级，通道之间还要平衡亮度。巨噬细胞密集的组织取高端，肿瘤间质里散在分布的取低端。

第一次做，从 1/1000 起。背景高就往上走，信号弱就往下走，一次调一档，不要跳。

三条操作建议

热修复这一步别省。膜蛋白的决定簇被甲醛交联遮住后，修复不到位染出来是空的，看着像阴性。

流式 1/60 到 1/100 这个区间偏浓。做表面染色时把细胞浓度压到每管一百万，孵育体积不超过 100 µL，否则按比例算下来抗体量会翻倍。

双标的时候 CD163 和 CD68 分两个通道看。两者都在单核巨噬系统里，CD163 更靠 M2 端，混在一个通道里看不出亚型差异。

下次配液，把 1/500 和 1/200 两个数并排写在记录本上，选一个先跑三张，看轮廓清楚再往下走。

关键参数

反应种属	Human, Mouse, Rat
抗原名称	CD163
验证应用	WB, IHC, FCM, MIHC
宿主/亚型	Rabbit / IgG
抗体类型	Monoclonal
纯化方式	Affinity purification Protein A
推荐稀释	IHC-P 1/500 Perform heat-mediated antigen retrieval with Tris/EDTA buffer pH 9.0 before commencing with IHC staining protocol.；mIHC 1/300 - 1/8000；WB 1/1000；Flow Cyt 1/60 - 1/100
储存条件	短期 +4°C；长期 -20°C

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