HA 只有一条小带，目的蛋白去哪了

HA 标签兔多抗，六项应用，未给固定稀释比

转染后四十八小时收样，HA 通道跑出来一条三十多 kDa 的强带，目的蛋白该在的位置什么都没有。学生问是不是标签掉了。

HA 是流感血凝素蛋白上的一段九肽，序列是 YPYDVPDYA。它被接到目的蛋白的 N 端或 C 端，用来做检测、纯化和定位。抗体认的就是这九个氨基酸。

任何带着这段序列的片段都会出带。所以那条小带不是污染，很可能是目的蛋白的降解片段，或者是一个被切下来的游离标签。

判这一点不难。把同一批样用抗目的蛋白的抗体再跑一次。那条带也认得出，说明是带了目的蛋白序列的片段；认不出，就只是游离的标签。

图 1　Western blot 验证结果（图源：proteintech 官网产品页）

一条小带说明什么

标签抗体的信号只跟标签走，不跟目的蛋白走。这个特点在判断降解时反而好用。

全长蛋白在七十 kDa，只看到三十 kDa 的带，说明分子从中间断了，断下来的那段还带着 HA。

如果是 C 端标签，断掉的那一半可能不带标签，WB 上完全看不见。这时候换 N 端标签的构建再验一次。

还有另一种情况。转染效率高、表达量过大时，蛋白来不及折叠就被降解，短片段的比例会明显上升。

还有一层容易被忽略。裂解液的去垢剂太强时，标签所在的结构域被部分展开，抗体结合效率下降，看上去像蛋白量少了。换温和一点的裂解液再跑一次，两条带的深浅关系常常会变。

这支的事实

兔多克隆，IgG，未标记。反应种属一栏是空的，标签抗体本来就不依赖种属。

应用六项，WB、ELISA、FCM、IF/ICC、IP。产品页没有给固定的稀释比，只列了应用范围。

多抗的好处是识别多个表位，标签暴露程度不同的时候也能出信号。代价是批间差异比单抗大。换批次要重新定稀释，不能沿用上一批的数。

ELISA 和 IP 对浓度的要求和 WB 不一样。WB 看的是比值，IP 要的是把蛋白拉下来，用量通常更高。

多抗的免疫原是一段偶联肽。偶联方式不同，批次之间对标签两端和中间的识别偏好会有差别。做定量比较时，同一批号用完再换，中途别混着用。

定量比较的前提

同一个构建、不同批次的裂解液，标签抗体的信号能差出一倍。做定量之前，先确认裂解效率和上样量都对齐。

内参选一个不带标签的。内参也带标签的话，检测时两个靶点抢同一支二抗，比值算不准。

建议

第一次用先做梯度。1/1000、1/2000、1/5000 三个点并排跑，选背景最干净的那个。

做 IP 时把裂解液的去垢剂浓度降一档。标签只有九个氨基酸，被去垢剂遮住之后抗体结合会掉。

上样量控制在每孔二十微克以内。标签抗体的背景主要来自过量上样，不是抗体本身。

显影别一路加时间。短片段信号强，长曝光之后全长那条弱带被压掉，看着就像彻底没了。先短曝一张，看清楚了再决定要不要加。

下次跑胶之前，先算一遍全长蛋白的理论分子量，把预测的位置标在膜背面，对着看有没有那条带。

关键参数

图 2　免疫沉淀 验证结果（图源：proteintech 官网产品页）

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