二抗太亮，把一抗的问题盖住了
驴抗兔 AF488，流式 1/2000 到 1/4000
双标片子上，488 通道整片泛绿，连红细胞都亮。647 通道该有的信号被压得看不见。一抗的量是照着单标实验抄的，二抗按说明书取 1/500。
二抗识别的是宿主种属，不认抗原。一抗加多了，二抗能结合的位置也跟着多，荧光一路上去。
很多人把二抗当显色剂用，觉得亮一点好看。荧光通道的亮度有上限，过曝之后弱信号就出不来了。
二抗的量该跟着一抗走
一抗浓度降一半，二抗可以不动或者略降。反过来，一抗加倍而二抗不动，背景会先起来。
双标时两个一抗来自不同种属，二抗才能分开。如果两个一抗都是兔源，二抗没法区分，只能做顺序染色或者直接标一抗。
顺序染色要加一步加热或者变性，把第一个一抗的位点破坏掉。这一步对某些表位是致命的。
还有一条容易忘。二抗的量是按一抗的体积算，不是按切片的面积算。片子大而薄的时候，铺满液面需要的体积比想象中多，按面积估会偏。
这支的事实
驴宿主，抗兔 IgG 的重链和轻链，Alexa Fluor 488 标记，多克隆。
应用四项，IHC、ELISA、FCM、IF/ICC。稀释给了两套，流式 1/2000 到 1/4000，ICC/IF 1/200 到 1/1000。
两套数差着五到十倍，不是写错了。流式的细胞是悬液，抗体接触面积小，浓度要低；贴壁细胞的片子要穿透，浓度得高。
驴抗兔的交叉反应低。做含小鼠一抗的双标时，这支不太会去认小鼠 IgG，这是选驴而不是选羊的一个实际原因。
两套稀释怎么落到操作上
流式按 1/2000 起，每管一百万细胞，孵育体积一百微升。这个量配下来抗体不到 0.05 微升，先做一次中间稀释再取。
贴壁细胞的片子按 1/200 到 1/1000。片子上的液体量小，一百到两百微升覆盖组织就够，不用淹过切片。
第一次做双标，两个二抗都取中间值。跑完看两个通道的强弱，再单独调一个，别同时动。
建议
二抗孵育一小时，室温，避光。时间长了背景会往上走，尤其是有内源荧光的组织。
洗涤用 PBS 加 0.1% Tween-20，三次，每次五分钟。荧光二抗洗不干净，片子放两天就一片雾。
封片用含抗淬灭剂的介质。488 淬灭快，拍完一片赶紧拍，别在灯下放着看。
配二抗先按 1/1000 试一张，看背景再决定往哪个方向调，别一上手就用 1/200。
关键参数
| 反应种属 | Rabbit |
| 抗原名称 | Rabbit IgG |
| 验证应用 | IHC, ELISA, FCM, IF/ICC |
| 偶联标记 | AF488 |
| 宿主/亚型 | Donkey / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 推荐稀释 | Flow Cyt 1/2000 - 1/4000；ICC/IF 1/200 - 1/1000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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