647 通道的信号，别调到最亮
驴抗兔 AF647，配 ab199093 同型对照
三标片子上，647 通道的信号总是最弱。同一张片子，488 一亮，647 就得把曝光拉到极限，噪点跟着上来。
这不是抗体的问题。远红通道的激发和发射都靠后，汞灯在这个波段能量低，换激光器会好一些。
还有一层。647 的量子产率比 488 低，同样的抗体浓度，出来的光子数本来就少。
远红通道的取舍
647 的优势是背景低。组织的自发荧光集中在蓝绿区，远红区几乎是干净的。信号弱但底子清，信噪比不一定差。
麻烦在于它和多标里的其他通道挤。三标如果用了 Cy5、APC 或者类似的远红染料，647 就没位置了。
排通道的时候先定 647，再排中间通道。远红可选的最少，反过来排容易卡死。
样品的固定方式也会影响这个通道。醛类固定时间长的组织，在远红区会出现一层均匀的弱背景，肉眼看不出来，一拉曝光就显形。
这支的事实
驴宿主，抗兔 IgG 的重链和轻链，Alexa Fluor 647 标记，多克隆。
应用四项，IHC、ELISA、FCM、IF/ICC。流式 1/2000 到 1/4000，ICC/IF 1/200 到 1/1000。
同型对照在说明里写了，是 ab199093，兔单抗 IgG 带同样的 647 标记。做胞内染色或者背景偏高的时候，这一管要带上。
多克隆的二抗识别重链和轻链。做 IP 之后的 WB 检测，二抗会同时认出 IP 用的兔 IgG 重链，在五十 kDa 附近多一条带。
同型对照怎么用
同型对照的作用是量出非特异结合的水平，不是量背景亮度。
同一批细胞分两管，一管加一抗加二抗，一管只加同型对照加二抗。两管的二抗浓度必须一致。
两管的信号差不到一倍的时候，这个靶点的信号就不可信。先怀疑一抗浓度，再怀疑固定透化。
建议
配液避光。647 对光敏感，配好的工作液当天用完，不要留到第二天。
多标排通道时把 647 放在末位染，减少前面步骤的光暴露时间。
流式做表面标记，1/4000 起试。这个浓度比 ICC 低五倍，先按低浓度跑，背景干净再考虑加。
同型对照那一管也要避光。放久了染料自己会掉，对照的信号比实验管还低，比出来的差值就是假的。封片剂选不含甘油的，甘油在远红区有自发荧光，一拉曝光就是一层雾。
三标的时候把 647 留给表达量最低的那个靶点，让弱的通道配干净的光谱，比三个通道都调亮管用。
关键参数
| 反应种属 | Rabbit |
| 抗原名称 | Rabbit IgG |
| 验证应用 | IHC, ELISA, FCM, IF/ICC |
| 偶联标记 | AF647 |
| 宿主/亚型 | Donkey / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 推荐稀释 | Flow Cyt 1/2000 - 1/4000 ab199093 - Rabbit monoclonal IgG (Alexa Fluor® 647), is suitable for use as an isotype control to complement this secondary antibody.；ICC/IF 1/200 - 1/1000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
相关产品
点击货号或品名可查看生知库产品页的完整参数与报价。
参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。