磷酸化抗体，先刺激再收
STAT3 pY705 兔单抗，WB 1/2000 起
293T 长到七成满，弃培养基，直接加裂解液刮下来。跑 STAT3 总蛋白很漂亮，同一张膜上 pY705 那条什么都没有。
同一天另一盘细胞，IL-6 刺激十五分钟再收，pY705 亮得需要压曝光。
抗体没问题。磷酸化位点是瞬时的，没刺激就没有信号，这是生物学，不是试剂。
磷酸化是瞬时的
STAT3 的 Y705 被 JAK 磷酸化之后才成二聚体，进核，启动转录。这个状态维持不了多久，磷酸酶一直在旁边等着。
细胞一旦裂开，磷酸酶跟着释放。冰上操作慢一点，信号就掉一截，这个损失在 WB 上看起来像是「表达低」。
收样这一步要快。弃培养基、加预冷的裂解液、刮下来、离心，全程冰上，裂解液里磷酸酶抑制剂现加，不能提前配好放着。
这支的事实
克隆号 EP2147Y，兔单抗，IgG。反应种属是人和小鼠。
应用列了六项，WB、IHC、FCM、IF/ICC、IP、Dot。一支抗体跨胞内流式、免疫沉淀和原位染色，做通路验证时省事。
说明里专门写了一句，检测磷酸化蛋白可能需要刺激。这句话不是免责声明，是操作前提。阳性对照最好用同一批细胞的刺激组，不要拿别的样本凑。
稀释跨度十倍，从哪端起
WB 写的是 1/2000 到 1/20000，中间差十倍。IHC-P 1/50 到 1/100，ICC/IF 1/500，胞内流式 1/500，IP 1/20。
WB 这个跨度是给不同丰度样本留的。稳转高表达细胞往 1/20000 走，原代细胞、组织裂解液往 1/2000 走。
IP 用 1/20 看着很浓，其实合理。免疫沉淀要的是把抗原拉下来，抗体量要够，跟 WB 显色不是一回事。
第一次做，从 1/5000 起。磷酸化信号弱就往下走，背景高就往上走，一次一档。
跨度宽还有一个用处。同一批样本分几管，用三个浓度同时跑，一次就能看出哪一档落在动态范围内。省下的是重复实验，多花的是抗体，这笔账做磷酸化的时候划得来。
三条操作建议
IHC-P 那一步必须在染色前做热修复，用 Tris/EDTA 还是柠檬酸按说明书走，修复不足核内信号会弱。
做流式检测胞内 pSTAT3，固定后破膜要彻底。磷酸化表位在核内，破膜不干净，染色上不去。
每次跑 WB 都放一个未刺激的阴性对照。没有阴性对照，亮的那条也可能只是非特异。
下次做刺激实验，把时间点排成一列，五分钟、十五分钟、三十分钟各收一管，先看信号在哪个点最强，再定后续条件。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse |
| 抗原名称 | STAT3 pY705 |
| 验证应用 | WB, IHC, FCM, IF/ICC, IP, Dot |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/50 - 1/100 Perform heat-mediated antigen retrieval before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/2000 - 1/20000 Stimulation may be required to allow detection of the phosphorylated protein. Please see images below for recommended treatment conditions and positive controls.；ICC/IF 1/500；Flow Cyt (Intra) 1/500 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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