软骨上清里才找得到

MMP13 兔多抗，五类应用四个物种

膝关节软骨刮下来称重，胶原酶消化两小时，离心收上清。跑完 WB，MMP13 那个位置干干净净，什么都没有。

同一批样本换成含 SDS 的裂解液重做，条带出来了，位置比上清里预期的那条低一截。

问题不在抗体，在取样。MMP13 是分泌出去的酶，留在细胞里的不多。

图 1　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

分泌蛋白，样本决定成败

MMP13 属于基质金属蛋白酶家族。刚译出来的时候带一段前肽，把催化中心压住，分泌到细胞外前肽被切掉，酶才动得了。

细胞裂解液里主要是还没运出去的那部分，量少，而且多是带前肽的形式。条件培养基里才是大头，跑出来的位置也更低，两条带的差别就在这里。

做软骨、滑膜这类样本，上清和细胞层一起收。上清超滤浓缩之后上样，细胞层另跑一板，两条线对着看，哪条是真信号一目了然。

只留细胞层，等于把大部分目标蛋白倒进了废液缸。这个损失在数据上表现成「表达低」，其实跟表达没关系。

这支的事实

兔多抗，IgG，没有标记。反应种属写了人、小鼠、大鼠、狗四个。

应用列了五项，WB、IHC、ELISA、FCM、IF/ICC。多抗识别多个位点，前肽切掉以后表位不一定全丢，这是它做分泌蛋白的方便处。

代价是背景。软骨基质成分杂，蛋白聚糖和胶原碎片多，多抗在这种样本里容易出一片雾。封闭液里加一点鱼明胶，比单纯用脱脂奶粉干净。

一支抗体跨五个应用，方便之处是不用为每个实验另找货号。但每个应用的最优条件要单独摸，不能一套参数走到底。

产品页没给固定稀释

这支的说明里没有写 WB 该用多少，也没有 IHC 的稀释比。

没写数字不代表可以随手加。自己拉一条梯度，1/500、1/1000、1/2000，同一天、同一块胶、同一批样本。

挑背景最干净、目标条带还看得见的那一档，记进本子。换批号要复核一次，多抗的批间差异比单抗明显。

梯度不要跨太大，一档一档走。跳档容易错过那个刚刚好的点，尤其在基质样本里，背景和目标条带常常一起变。

三条操作建议

做 IHC 的片子，柠檬酸和 EDTA 两种修复液各试两张。软骨致密，修复不到位染出来是空的，容易被判成阴性。

用这支做 ELISA 夹心，先确认它认的是变性后的线性表位还是天然构象。多抗两种都可能，标不出来先换包被顺序，不要急着换抗体。

流式做胞内染色，固定破膜后多洗一遍。基质蛋白粘管壁，背景会拖尾。

下次收样本，上清和细胞层各留一管，别只留一样。

关键参数

图 2　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

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