1/2000 的二抗，别按 IF 用
山羊抗兔 AF647，流式 1/2000
流式做表面染色，同型对照和样本一起跑。样本整群往右移，同型对照也移了一点，空白管还多出一片拖尾。
查配液记录，二抗按 IF 的 1/500 加的，而说明书上流式那一栏写的是 1/2000。
二抗过量在流式上不是「亮一点」的问题，是整群偏移加背景抬高，分群线根本画不出来。
二抗过量会怎样
荧光二抗的结合位点有限，过量之后多余的抗体留在缓冲液里，洗涤洗不干净，非特异吸附到细胞表面。
表现在数据上，阳性群变亮，阴性群也变亮，两个群的间距没变，但坐标轴不够用了。
AF647 的量子产率高，激发在红色通道，本身信号就强。这类染料在流式上的用量比传统 FITC 二抗要省。
更麻烦的是拖尾。多余的抗体粘在细胞表面，洗涤洗不掉，阴性群整体右移还带一条尾巴，门的位置怎么调都不对。
这支的事实
山羊抗兔 IgG，H&L 全片段，多抗，带 Alexa Fluor 647 标记。目标是人以外的兔源一抗，也就是所有兔单抗、兔多抗都能配。
应用列了 IHC、ELISA、FCM、IF/ICC。流式推荐 1/2000，ICC/IF 是 1/200 到 1/1000。
两个数字差十倍。同一个实验里既做流式又做爬片的话，要配两份工作液，别图省事用一瓶。
H&L 指的是重链和轻链都认，所以它能配完整 IgG，也能配片段化抗体。做 Fab 一抗的时候这一点用得上。
补偿要单独做
AF647 的发射峰在远红端，跟 APC、Cy5 有重叠。多色方案里必须要单染补偿管。
补偿管用阳性细胞加这支二抗单独染，不要拿全染的样本当补偿。
如果仪器配的是 640 nm 激光，AF647 的激发效率最高。换 633 nm 的机器，亮度会差一点，补偿矩阵要重做。
补偿做完，把矩阵存成模板。下次同一个面板直接用，省一轮调机时间。
三条操作建议
流式按 1/2000 配，一管一百万细胞加 100 µL 工作液。细胞数翻倍，体积跟着翻，别只加抗体不加体积。
ICC/IF 从 1/500 起，1/200 那一端留给表达弱的样本。荧光背景高就先降一抗浓度，别急着降二抗。
配好的工作液当天用完。AF 系列染料避光要求高，放冰箱过夜再用，亮度会掉一截。
一抗浓度和细胞数也影响分群。二抗定了之后，先动一抗，别两头一起改。
下次做多色，先把这支二抗的单染补偿管排在方案第一管，后面的通道才好调。
关键参数
| 反应种属 | Rabbit |
| 抗原名称 | Rabbit IgG |
| 验证应用 | IHC, ELISA, FCM, IF/ICC |
| 偶联标记 | AF647 |
| 宿主/亚型 | Goat / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 推荐稀释 | Flow Cyt 1/2000；ICC/IF 1/200 - 1/1000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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