ELISA 用到 1/80000

山羊抗兔 HRP，WB 1/2000 起

板子显色，空白孔也发黄。洗了五遍还是这样，底物换了一瓶新的也没用。

查配液记录，二抗按 WB 的 1/2000 加的。ELISA 那一栏写的是 1/20000 到 1/80000。

差了十倍到四十倍。HRP 二抗在板子上过量，洗不掉的酶直接跟底物反应，空白孔就黄了。

HRP 为什么省着用

HRP 是酶标，一个分子能催化很多底物分子，信号是放大的。用量不需要像荧光二抗那样堆。

过量之后，酶粘在板壁和封闭蛋白上，洗涤只能去掉一部分，剩下的持续催化，本底越来越高。

ELISA 的读数窗口本来就窄，本底一抬，低浓度样本的差值全被压平。

ELISA 的窗口比 WB 窄得多。WB 过曝还能靠压曝光救，板子读出来顶格就没办法了，只能重做。

这支的事实

山羊抗兔 IgG，H&L 全片段，多抗，带 HRP 标记。做过吸附处理。

吸附这一步是把跟其他物种 IgG 交叉反应的部分去掉。做多物种样本、或者样本里混有内源免疫球蛋白时，这一步能降背景。

应用列了五项，WB、IHC、ELISA、IF/ICC、Dot blot。一支二抗覆盖五个场景。

稀释给的是 WB 1/2000 到 1/10000，ELISA 1/20000 到 1/80000。两个应用差着一个数量级。

H&L 全片段的好处是能配完整 IgG 和片段化抗体，做 Fab 二抗时不用另买。

两个稀释差一个数量级

WB 上蛋白转在膜上，抗体要渗进膜的空隙，浓度低了结合不上，所以从 1/2000 起。

ELISA 里抗原包在板底，是平面，抗体扩散容易，加上酶放大，浓度可以压得很低。

用错的那一端，WB 会没信号，ELISA 会满板黄。这两个错法表现完全相反，判断时容易往抗体质量上想。

如果板子信号整体偏低，先查包被和一抗，不要直接加二抗浓度。加浓容易把本底一起抬起来。

三条操作建议

ELISA 从 1/40000 起，1/20000 留给信号弱的板子。配好之后先跑一条标准曲线，看最高点和最低点的差值。

WB 用 1/5000 做常规，1/2000 留给表达量低的样本。别一上来就用最浓的那端。

底物现配现用。TMB 放久了自身会变蓝，跟抗体没关系。

封闭用 5% 脱脂奶粉，板子封闭一小时以上。封闭不充分，二抗会粘在没被覆盖的塑料上。

读板前把板底擦干净。指纹和气泡在 450 nm 上的影响比想象中大。

下次配二抗，把 WB 和 ELISA 两个稀释比分别写在两个管子上，别用同一管来回兑。

关键参数

反应种属	Rabbit
抗原名称	Rabbit IgG
验证应用	WB, IHC, ELISA, IF/ICC, Dot
偶联标记	HRP
宿主/亚型	Goat / IgG
抗体类型	Polyclonal
纯化方式	Affinity purification
推荐稀释	WB 1/2000 - 1/10000；ELISA 1/20000 - 1/80000
储存条件	短期 +4°C；长期 +4°C

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品牌	货号	品名
Abcam	Ab7090	Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) preadsorbed 本文产品
Abcam	Ab97080	Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) preadsorbed
Abcam	Ab6721	Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)
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