iNOS 131 kDa，跑胶要慢

iNOS 兔多抗，131 kDa，只写小鼠

巨噬细胞极化诱导三天，收蛋白跑 iNOS。转膜一小时，Ponceau 染了看，大分子区一片空白。

目标蛋白标的是 131 kDa，这个位置用常规的湿转条件，很容易转不干净。

同一样本换成低温低压过夜转膜，条带出来了，而且很干净。

它是诱导型的酶

iNOS 又叫 NOS2，催化精氨酸生成一氧化氮。跟内皮型的 eNOS、神经型的 nNOS 不一样，它在静息细胞里基本不表达。

要看到它，得先给诱导条件。LPS 加干扰素，或者细胞因子混合物，刺激足够时间才有蛋白。

这也是它作为 M1 极化标记的原因。表达量本身就是表型读数，不需要看活性。

还有一层是底物。iNOS 的活性需要四氢生物蝶呤和钙调蛋白，蛋白表达出来不等于有活性，功能实验要另测亚硝酸盐。

这支的事实

兔多抗，IgG，不带标记。反应种属只写了小鼠一个。

应用列了两项，WB 和 IHC。分子量标的是 131 kDa，编号 P29477。

只写小鼠这一点要先注意。做人的样本、大鼠的模型，都别直接套。

多抗识别多个位点，iNOS 跟 nNOS、eNOS 之间有同源区，做 WB 时如果样本里同时表达另外两种，可能看到额外条带。

IHC 在炎症组织里背景会高。中性粒细胞的髓过氧化物酶也催化底物，DAB 显色时间别拖太长。

大分子转膜是主要瓶颈

131 kDa 在常规胶里跑不快。分离胶浓度降到 8% 或者用梯度胶，让大分子进得去。

转膜用湿转，不要用半干。半干的电场强，大分子容易卡在胶里出不来。湿转加 0.05% SDS 到转膜液里，帮助蛋白从胶里出来。

电流控制在 200 mA 以内，低温过夜。高电流发热，胶会变形，条带跟着歪。

转完先用丽春红染膜确认，看不到蛋白就说明没转过去，后面孵育再久也是白费。

转完膜别急着孵育，先用丽春红看一眼。这一步五分钟，能省下一整天。

三条操作建议

诱导时间给足。iNOS 的蛋白表达有延迟，刺激六小时就能看到一点，十二到二十四小时更稳。

IHC 用在小鼠组织上，抗原修复选 EDTA pH 9.0。iNOS 在胞质，判读时跟核染分开。

WB 上样量不要省，每孔至少三十微克。iNOS 只在诱导后表达，丰度低，上样少了看不到差异。

如果条带一直弱，先怀疑诱导，再怀疑上样量，换抗体放到第三步。

下次跑大分子，把胶浓度、转膜电流、时间三项写在同一张标签上贴电泳槽，别人接手也不会跑错。

关键参数

反应种属	Mouse
抗原名称	NOS2
验证应用	WB, IHC
宿主/亚型	Rabbit / IgG
抗体类型	Polyclonal
纯化方式	Affinity purification Immunogen
储存条件	短期 +4°C；长期 -20°C

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