二抗浓了，满片都是绿的
山羊抗小鼠 AF488，流式 1/2000
小鼠单抗染细胞，二抗按 1/500 加，荧光显微镜下整个胞质一片绿，看不到结构。
把一抗撤掉，只加二抗，还是一片绿。
这不是一抗的问题，是二抗浓度太高，加上样本本身有内源免疫球蛋白结合。小鼠组织配小鼠来源一抗，这个坑绕不开。
二抗浓度决定背景高低
二抗的工作原理是认一抗的恒定区。浓度上去以后，多余的二抗会非特异地贴在细胞膜和胞质上。
荧光通道尤其明显，因为荧光基团本身有自发信号，洗不干净就一直在那儿亮。
流式给到 1/2000，说明这支效价高。做 IF 也不能按常规 1/500 起，1/200 到 1/1000 是产品页给的范围。
洗的条件跟着改，PBST 洗三次每次五分钟，浓度降下来以后洗涤次数可以减。
还有个容易忽略的点是稀释液。用含血清的封闭液配二抗，血清里的免疫球蛋白会先占掉一部分，有效浓度比算出来的低。
这支的事实
山羊抗小鼠 IgG，重链轻链全长，多抗，Alexa Fluor 488 标记，做过吸附处理。
应用列了 IHC、ELISA、FCM、IF/ICC 四项。稀释比，流式 1/2000，ICC/IF 1/200 到 1/1000。
缓冲液是 PBS 加 23% 甘油和 1% BSA，含 0.02% 叠氮钠。
保存条件里写了避光，-20°C 稳定十二个月。荧光基团怕光，取用的时候别在台面上摊太久。
全长指的是重链加轻链，做小鼠 IgM 一抗时也能用。
吸附处理解决了什么
血清里有很多抗其他物种的抗体，做多物种组织时会产生交叉。
吸附是把这些交叉反应抗体提前吸掉，代价是效价略降，好处是背景干净。
做小鼠组织加小鼠一抗，内源免疫球蛋白仍然是主要背景来源，吸附处理管不了这一段。这种情况要另想别的办法。
荧光二抗的偶联率按批号有差别，换批先拿一张阳性片试，别直接按上一批浓度上。
做多重荧光，二抗的宿主要和另外几支一抗错开，山羊、驴、鸡各选一个，串色的概率会低很多。
三条操作建议
IF 从 1/500 试，信号弱再往 1/200 走，流式直接用 1/2000。
封片用抗淬灭封片剂，普通甘油封片放两天就褪。
封闭用 5% BSA 加 10% 正常山羊血清，把内源位点先占住。
做流式时细胞先计数，每管 10^6 个，二抗体积按 100 微升给，量少染不匀。
全程避光，封片后用指甲油封边，四度保存，当天拍完。
下次配二抗，按孔数算用量，别一次配一大管放着。
关键参数
| 反应种属 | Mouse |
| 抗原名称 | IGHG1 |
| 验证应用 | IHC, ELISA, FCM, IF/ICC |
| 偶联标记 | AF488 |
| 宿主/亚型 | Goat / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 推荐稀释 | Flow Cyt 1/2000；ICC/IF 1/200 - 1/1000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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