产品性能解析 · Abcam

抗 GFP 也会认降解片段

山羊多抗，全长 GFP 免疫原

Abcam · 货号 Ab6673

抗 GFP 也会认降解片段

稳定表达 GFP 融合蛋白的细胞，收裂解液跑 WB，预期位置有带，下面还有两条弱带。

用抗标签的抗体再跑一遍，弱带还在。

融合蛋白在细胞里会被部分降解，标签被切下来以后单独跑，位置就低了。

图 1　免疫组化验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

全长免疫原的利与弊

这支的免疫原是重组全长 GFP，来自维多利亚水母，带 UniProt 号。

全长免疫原做出的多抗表位分布广，GFP 的各种构象和部分片段都可能被认出来。

利是做免疫沉淀、做免疫荧光都稳，变性不变性都能用。弊是 WB 上会把降解片段一起显出来，条带不止一条。

做免疫荧光时固定后的 GFP 荧光会掉一部分，抗体补回来的是位置，不是亮度。

另一种情况是融合蛋白被截短。构建时如果丢了一段，条带位置也会低，先看质粒测序结果，再怀疑降解。

山羊多抗，IgG，无标记，亲和纯化。

应用列了 WB、IHC、ELISA、IF/ICC、IP 五项。产品页另提到在冰冻切片和免疫荧光上做过验证。

种属一栏是空的，这支不针对某个物种，认的是标签本身。

缓冲液是氯化钠加磷酸钾溶液，pH 7.2，含 0.01% 叠氮钠。这个配方没有甘油，冻融要注意。

宿主是山羊。二抗要选抗山羊的，不能和抗兔、抗小鼠的混用。

产品页没有给稀释比，只能自己摸。WB 从 1/1000 起，IF 从 1/200 起，往上往下各试一档。

第一是二抗。实验室常备的是抗兔和抗小鼠，抗山羊的需要另配。

第二是多标。做双标时如果另一支一抗也是山羊来源，两支会抢同一个二抗。

抗山羊二抗的种属交叉比抗兔的宽，做小鼠组织时非特异多一些，封闭液里加正常兔血清能压一部分。

替代方案是把 GFP 这一通道换成直标，或者用兔源抗 GFP 做另一通道。

实验室没有抗山羊二抗是常有的事。短期可以借一支直标的应急，长期还是备一支，不然这支用不起来。

WB 检测融合蛋白，同时跑一管只表达 GFP 的对照，把标签本身的条带位置标出来。

免疫沉淀后跑胶，重链在 50 kDa 附近，目标蛋白也在这段就换直标二抗。

IP 用 1% Triton 裂解液，4°C 孵育过夜，山羊 IgG 和 Protein A 的结合弱，用 Protein G 更稳。

IF 做固定样本，4% 多聚甲醛固定十五分钟，GFP 的荧光在固定后会掉，靠抗体补回来。

下次做融合蛋白，先跑一管空载对照，别把标签片段当成目标蛋白。

图 2　细胞免疫荧光验证结果（图源：Abcam 官网产品页）