p65 的磷酸化，五分钟就过去了
兔多抗，仅人样本，60 kDa，WB 与 IHC-P
做 NF-κB 通路，TNF-α 刺激后收样，p65 的 S536 磷酸化条带很漂亮。
同一批细胞，刺激六十分钟的那一管，带几乎没了。
第一反应是操作失误，重复三次，结果一样。
pS536 是一个快速上升又快速下降的修饰，取样时间点比抗体本身更决定结果。
刺激五分钟和六十分钟不是一回事
TNF-α 刺激后，S536 的磷酸化在几分钟内到峰值，半小时后开始回落。
做时间梯度，五分钟、十五分钟、三十分钟、六十分钟各收一管，先看清自己体系的窗口。
收样要快，培养基一倒，立刻加预冷的裂解液，磷酸酶抑制剂现加，别提前配好放着。
样本在冰上放太久，磷酸化信号自己会掉，这个掉法跟抗体好坏无关。
一次收八个时间点的话，提前把裂解液和抑制剂按管分装好，收样时只加不配，手就不会乱。
磷酸化的 WB 还有一层：上样量超过 30 µg 时背景条带会盖住目标带，宁可少上多曝。
这支的事实
兔多抗，IgG，无标记，Protein A 亲和纯化。
种属只写了人，应用只列了 WB 和 IHC-P，分子量 60 kDa。
免疫原是 RELA 第 536 位丝氨酸磷酸化位点附近的合成肽，跨物种保守性产品页没有写。
缓冲液是 Tris 缓冲盐加 0.1% BSA，pH 6.8 到 7.4，含 0.09% 叠氮钠。
产品页明确写了不要冻存，反复冻融会掉效价，只能 4°C 存放。
缓冲液里叠氮钠含量 0.09%，做细胞染色前要稀释或透析，直接加到活细胞里有毒性。
稀释抗体用含 1% BSA 的 TBST，比稀释在奶粉里背景低一档。
IHC 上的核染判断
p65 静息时在胞质，激活后进核，所以 pS536 的阳性应该是核染。
如果整片胞质都亮，先怀疑抗体浓度过高，或者修复过度。
阳性对照组织选刺激过的细胞团或者炎症组织，正常组织里核染很少。
判断标准是核内信号与胞质信号的比值，不是绝对亮度，亮度受曝光和显色时间影响太大。
核染的片子还要报阳性细胞百分比，只说有阳性没有说服力。
三条操作建议
封闭用 5% BSA，不用脱脂奶粉，磷酸化抗体在奶粉里背景会明显升高。
一抗 4°C 过夜，稀释比产品页没有给，从 1/1000 起试，按背景调。
收样时每管直接加等体积 2× 上样缓冲液，煮沸五分钟，别在冰上排队等。
下次一次跑四个时间点，同一块胶，每孔 20 µg，把窗口定下来。
关键参数
| 反应种属 | Human |
| 抗原名称 | RELA pS536 |
| 验证应用 | WB, IHC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 +4°C |
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