波形蛋白染得满片都是，先看阴性对照
Anti-Vimentin [EPR3776]，兔单抗，WB 1/1000 起
切片孵到四度过夜，第二天 DAB 显色，间质一片棕色。
你把片子拍照存档，觉得这批 EMT 诱导做得漂亮。翻到同一张玻片上没加一抗的阴性对照，那个位置也带着一层浅棕。
波形蛋白这种靶点，假阳性比假阴性常见。
为什么容易染过头
波形蛋白是中间丝蛋白，在间质细胞里含量极高。成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞都表达，切片里这些成分本来就多。
它的表位又耐热，柠檬酸缓冲液高压修复之后暴露得更彻底。修复过了头，抗体就更容易贴上去。
做肿瘤间质评估时这个特点会被放大。肿瘤周边的反应性间质、血管壁、坏死区边缘，都会带上颜色，真正想看的肿瘤细胞反而不好分辨。
所以看一支波形蛋白抗体行不行，不看阳性有多深，看阴性有多干净。
EPR3776 的事实
Ab92547 用的是 EPR3776 克隆，兔单克隆，IgG 亚型，识别人、小鼠、大鼠、猴的波形蛋白。
验证应用是 WB、IHC-P、流式胞内染色、ICC/IF 和多重免疫组化。一支抗体覆盖五个系统，要做多平台验证的课题会省事。
稀释比是分开给的。WB 1/1000 到 1/5000，IHC-P 1/200 到 1/500，修复用柠檬酸缓冲液 pH 6，需要热介导。ICC/IF 给的是 2 微克每毫升，不是稀释比。流式胞内 1/50 到 1/500，同型对照推荐 ab172730。
同一批样本，WB 用 1/5000，IHC 用 1/200，中间差了二十多倍。这两个数不能互相搬。
敲除株这个对照值得做
厂家给 ICC/IF 的验证数据时，阳性细胞用 HeLa，阴性对照用的是波形蛋白敲除的 HeLa。这个设计比「不加一抗」严格得多。
不加一抗只能排除二抗和显色的非特异。敲除株能把抗体认错蛋白的可能一起排掉。
自己做 IHC 手上没有敲除株，退一步的做法是找一块已知不表达波形蛋白的组织，跟样本同批染色。这一块片子比多买一支抗体便宜。
WB 上判断更直接。敲除样本的泳道应该干净，出了带就说明抗体认了别的东西。
三条操作上的事
IHC 从 1/200 起，不要一上来就按 WB 的 1/5000 稀释。两个系统的抗体浓度差一个数量级。
多重免疫组化里波形蛋白信号强，容易压掉同片上的其他标记，做多标时把它放到末轮。
流式的胞内染色要固定破膜。波形蛋白挂在中间丝上，破膜不彻底信号会掉一半，这一步比反复调抗体浓度更值得花时间。
下一批切片，切一块阴性对照下去，跟样本泡在同一个湿盒里。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat, Monkey |
| 抗原名称 | VIM |
| 验证应用 | WB, IHC, FCM, IF/ICC, MIHC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/200 - 1/500 Perform heat-mediated antigen retrieval with citrate buffer pH 6 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/1000 - 1/5000；ICC/IF 2 µg/mL This product gave a positive signal in HeLa (VIM knockout HeLa cells were used as a negative control) fixed with 4% formaldehyde (10 min) and 100% methanol (5 min).；Flow Cyt (Intra) 1/50 - 1/500 ab172730 - Rabbit monoclonal IgG, is suitable for use as an isotype control with this antibody. |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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