LC3B 两条带，别只量下面那条
Anti-LC3B [EPR18709]，兔单抗，WB 1/2000
自噬的课题，膜上跑出两条带，下面那条深，上面那条浅。
同学只量了下面那条，处理组比对照组高，结论写成自噬增强。
审稿意见回来问，溶酶体抑制剂组的比值是多少。
他没有做这一组。
两条带分别是什么
LC3 合成出来是前体，加工之后成为胞质型的 LC3-I，跑得靠下。
自噬体形成的时候，LC3-I 会被加上一个磷脂酰乙醇胺，变成 LC3-II，疏水性强，跑得靠上，条带位置略高。
自噬增强，两条带都可能变多；自噬流被阻断，II 带也会堆起来。
只看 II 带的绝对量，分不清是合成多了还是降解堵了。
II 带在转膜的时候比 I 带更容易转过头，半干转的电流别给太高，湿转过夜更稳。
判读要带抑制剂组
标准做法是加一组溶酶体抑制剂，氯喹或巴弗洛霉素，处理最后几个小时。
加了抑制剂之后 II 带继续升高，说明流是通的；不升高，说明上游就堵住了。
这一步不做，任何 LC3 的结论都站不住。
抑制剂的浓度和处理时间要写进记录。氯喹给早了，自噬还没起来就先堵住，结果看不出来；给晚了，信号已经降解完。
荧光成像里数 puncta，逻辑一样，同样要有抑制剂组做对照。
这支抗体的条件
靶点是 MAP1LC3B，反应种属写的是人、小鼠、大鼠。
宿主兔，单克隆，克隆号 EPR18709。验证系统是 WB、IHC-P 和 ICC/IF。
WB 给 1/2000，这个稀释比在单抗里算省的，一支能用很久。
IHC-P 给 0.1 到 1 µg/mL，跨度十倍。跨度大说明不同组织的表达量差得多，肝、脑、肌肉要分开定。
ICC/IF 1 µg/mL，看的是胞质里的点状信号。
IHC 上的判读
LC3B 在切片上是胞质点状，不是均匀的胞质染色。
正常组织里阳性很弱，缺血、饥饿、药物处理之后才明显。低倍下看不出来是正常的。
0.1 µg/mL 这一档是给高表达组织用的，普通组织从 0.5 起步比较稳。
背景重的时候先降浓度，别先换修复液。柠檬酸 pH 6 的热修复是产品页给的条件，改了这一项，前面定的浓度就作废了。
不同组织的表达量差得远。肝和骨骼肌的阳性弱，脑和心肌相对明显，同一批切片里放一块已知阳性的组织做参照，判读才有底。
明天把氯喹组补上，两条带分别定量，算 II 带与 I 带的比值，再把 IHC 的浓度从 0.5 µg/mL 往下走一档。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | MAP1LC3B |
| 验证应用 | WB, IHC, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 0.1-1 µg/mL Perform heat-mediated antigen retrieval with citrate buffer pH 6 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/2000；ICC/IF 1 µg/mL |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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