50 kDa 那条带，别和它抢位置
Anti-beta III Tubulin 兔多抗，敲除验证
做原代神经元的那组，第十四天收样跑胶。目的蛋白在 48 kDa，内参选了 beta III Tubulin，显出来一条很粗的带。
问题是两条带挨得太近，扫膜的时候框重叠，定量软件把灰度算到了一起。
换内参不是唯一解法，先弄清楚这条带为什么在这个位置。
TUBB3 是神经元的结构蛋白
beta III Tubulin 是微管蛋白的一个亚型，在神经元里高表达，也是神经前体细胞往神经元分化时最早变化的标志之一。
产品页标的分子量是 50 kDa。微管蛋白在细胞里不是单体，它会聚成微管，也会形成二聚体。样本裂解得不够彻底的时候，部分蛋白以聚合态存在，进胶慢，条带会往上拖。
煮沸时间也有影响。微管蛋白对反复冻融和长时间高温敏感，煮十分钟以上容易看到聚集在浓缩胶边上。
敲除验证与种属覆盖
产品页写明这支的特异性在敲除样本里做过确认。对多抗来说，这一条比什么都实在。
多抗是混合克隆，不同批次之间的表位偏好会有差异。敲除样本做出的阴性结果，说明在这套体系里，抗体认的就是这个基因的产物，不是别的蛋白碰巧同位置。
做流式胞内染色的时候，这一条尤其重要。固定破膜之后，细胞里的结构蛋白暴露面变了，非特异结合的机会增加。带一个敲除或者敲低样本做对照，比单纯看同型对照更有说服力。
反应种属是人、小鼠、大鼠、猴、鱼。
鱼样本在神经发育研究里用得不少，斑马鱼的脊髓和视网膜结构清楚。做这类样本的时候，固定时间和脱钙步骤会影响染色，抗体本身的交叉反应通常不是瓶颈。
猴的样本更多用在毒理和示踪，切片往往已经存了一段时间。存档切片的抗原性下降，修复强度要往上提一档再试。
与常见内参的位置冲突
beta III Tubulin 在 50 kDa，beta actin 在 42 kDa，GAPDH 在 36 kDa 附近。三个数挨得近，配胶浓度低的时候容易挤在一起。
做神经样本，如果目的蛋白也在 45 到 55 kDa 之间，把胶的浓度提到 12%，或者干脆分两块胶跑。
扫膜的框要手动划，不要用自动识别。相邻条带被框进去一点，定量结果就偏一成。
三条操作建议
裂解液里加足够的去垢剂，微管蛋白在温和裂解条件下容易留在不溶相，上清里的量偏低。收样后超声几秒，比单纯涡旋有效。
孵育温度统一。四度过夜和室温两小时，条带的锐度不一样，同一次实验里不要混着来。
流式做胞内染色，破膜后加一步封闭，用含血清的缓冲液孵育二十分钟再上抗体。
下次配胶前，先看一眼目的蛋白的分子量，和 50 kDa 隔开 5 kDa 以上，再决定用不用这支做内参。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat, Monkey, Fish |
| 抗原名称 | TUBB3 |
| 验证应用 | WB, IHC, FCM, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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