这支 4-HNE，瓶子上写着不要冻

Anti-4-HNE 兔多抗，只做过 WB 验证

冰箱里翻出一支 4-HNE 抗体，上次用完放进了负二十度。这次拿出来跑胶，膜上是一片云，没有清楚的带。

抗体没坏在保质期上，坏在储存方式上。产品页的储存条件写得很直白，推荐四度，附带一句不要冻。

图 1　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

4-HNE 不是一种蛋白

4-HNE 是脂质过氧化的醛类产物，它本身只有 0.1 kDa 量级，不会单独出现在胶上。

检测到的信号，是 4-HNE 和蛋白的赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸残基形成的加合物。加在哪个蛋白上，取决于样本里哪些蛋白丰度高、哪些位点暴露。

所以一张膜上出现多条带是正常现象，不能按单一条带的标准去判读。凡是看到分子量呈梯状分布的信号，先怀疑是不是这类修饰抗体。

也正因为加合物分布广，这支没有列反应种属。它认的是修饰基团，不是某个物种的序列。

不同组织里加合物的基线水平差别很大。肝和肾的脂质代谢活跃，未处理样本上就能看到几条弱带；脑组织低一些，同样上样量下背景干净得多。做多组比较的时候，每组都要有自己的未处理对照，不能拿一组的基线去套另一组。

只做过 WB，别的别硬上

应用栏只有一项 WB。

有人拿它去做 IHC，切片上染出一片棕色，看着像阳性。这类修饰抗原在固定和包埋过程中会继续反应，也可能被醛类固定剂封闭，信号的真假很难说清。产品页没给 IHC 的验证，做出来的结果自己也没法解释。

做 WB 也要带对照。阴性对照是不加氧化诱导的样本，阳性对照可以用紫外照射或者药物处理过的细胞。两边都跑，才知道那条带是诱导出来的还是本来就在。

缓冲液里没有甘油

这支的缓冲液是 PBS 加 0.09% 叠氮钠，pH 7.2 到 7.4，没有甘油，也没有载体蛋白。

没有甘油的抗体，冻融时的冰晶会直接伤到蛋白。这支的说明书因此要求四度保存，不做冷冻。

如果已经冻过，别急着丢。先跑一块胶，和一支没冻过的并排比。条带变糊、位置偏移、背景抬高，都是损伤的表现。

规格是 100 µg。按常规 WB 稀释比用，一支能跑不少块胶，不必为了省而稀释过头。

三条操作建议

上样量往下压。修饰蛋白丰度低的时候容易被背景埋掉，丰度高的时候又容易过曝。先跑一个梯度上样，找到条带清楚、背景干净的那一档。

转膜用 0.45 µm 的膜。小分子量加合物的迁移位置接近染料前沿，孔径太小的膜会截留一部分，信号偏弱。

定量只比整条泳道的总信号，不要挑单条带。加合物的分布随处理条件变化，挑带比会得出错误结论。

下次收完样，把这支从负二十度挪到四度那层，标签上补一句不冻。省下的不只是抗体。

关键参数

图 2　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

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参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。