内参没条带，先查二抗那一栏
Beta Actin 单抗，小鼠 IgM，认五个种属
一块胶跑完，目的条带清清楚楚，内参那一列却是空白。第一反应是上样量不够，补了蛋白再跑，还是空白。
换了一支新配的二抗，结果一样。问题不在抗体，在抗体的类型上。
这支的宿主是小鼠，亚型 IgM。实验室冰箱里常备的二抗，多半是抗小鼠 IgG。
抗 IgG 的二抗，为什么认不上 IgM
IgG 和 IgM 的重链不是一回事。IgG 的重链是 γ，IgM 的重链是 μ。抗小鼠 IgG 的二抗，结合位点在 γ 链的 Fc 段，对 μ 链没有亲和力。
所以样本里有抗体、膜上也有抗原，二抗就是贴不上去。显影液倒上去，膜还是干净的。
判断的办法很直接，翻产品页的宿主那一栏。写 Mouse / IgM，二抗就得选抗小鼠 IgM 的，或者选标注了识别全部免疫球蛋白类别的那种。
另一条路是把二抗换成 H&L 型的抗小鼠，这类通常同时认轻链，IgM 和 IgG 都能结合。代价是轻链共通，做免疫沉淀后的检测时，重轻链的干扰会一起进来。
免疫原覆盖的是 14 到 167 位
这支的免疫原是大肠杆菌表达的重组人 beta actin，带 GST 标签，片段落在 14 到 167 位氨基酸。
这一段在 actin 家族里相当保守。哺乳动物的 beta 和 gamma 胞质 actin 在这个区间几乎一样，所以抗体分不清 ACTB 和 ACTG1，这在做内参的时候不算缺陷，做亚型特异的时候就要注意。
全长 376 个氨基酸。免疫原只用了一小段，好处是抗原制备稳定，坏处是如果目标蛋白在这一段有突变或者剪接缺失，抗体就认不上。
五个种属，植物也在里面
反应种属写的是人、小鼠、大鼠、斑马鱼、植物。
植物样本能上，是因为 actin 在真核生物里保守到这种程度。做拟南芥或者水稻的内参，这支可以直接试。
斑马鱼要注意上样量。胚期样本里卵黄蛋白占比高，同样总蛋白量下 actin 的相对量会被稀释，条带偏淡不等于抗体不行。
三条操作上的建议
缓冲液是 PBS 加 0.02% 叠氮钠和 50% 甘油，pH 7.3，负二十度存放，说明书说不必分装。甘油本身降了冰点，反复取用对效价影响小，但仍建议用的时候手快，别让管子在外面放太久。
纯化方式是辛酸硫酸铵沉淀，不是亲和层析。这类纯化得到的抗体里会带少量非 IgG 类的杂蛋白，做 IgM 的时候反而保住了五聚体，跑非还原胶能看到高分子量的带。
内参的稀释比要和目的抗体一起定，不要各自为政。同一次实验里两个抗体的孵育时间统一，条带强弱才好比较。
明天开工前，翻一下二抗瓶子的标签，看是抗 IgG 还是抗 IgG+IgM。这一行字，省掉一整天的重跑。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat, Zebrafish, Plant |
| 抗原名称 | Beta Actin |
| 验证应用 | WB, IHC, ELISA, IF/ICC, IF-P |
| 偶联标记 | Unconjugated |
| 宿主/亚型 | Mouse / IgM |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Caprylic acid/ammonium sulfate precipitation |
| 储存条件 | Store at -20°C. Stable for one year after shipment. Aliquoti |
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