mTOR 的磷酸化，怕饿
mTOR pS2448 兔单抗，IHC-P 1/50 起
肾纤维化模型收样，对照组和造模组一起跑 p-mTOR。对照组的条带也很亮，造模组反而不高。
第一反应是抗体不特异。翻实验记录才发现，动物处死到冻存之间隔了二十多分钟，取材当天空腹也没统一。
mTOR 的磷酸化对营养状态极敏感，这批样本的背景已经被操作抹平了。
两个位点，两套复合物
mTOR 有两个常被检测的磷酸化位点。S2448 是 mTORC1 自己磷酸化的，反映通路活性。另一个位点在 mTORC2 上，意义不同。
买抗体时看清位点，别拿 S2448 的数据去讲 mTORC2。
S2448 的信号还跟溶酶体位置有关。饥饿的时候 mTOR 从溶酶体膜上下来，磷酸化跟着掉。这个变化在半小时内就能发生。
这支的事实
克隆号 EPR426(2)，兔重组单抗，IgG。反应种属是人和小鼠。
应用四项，WB、IHC-P、IHC-Fr、Dot blot。稀释分别是 WB 1/1000 到 1/10000，IHC-P 1/50 到 1/100，冰冻切片 1/200，Dot 1/1000。
重组单抗的批间一致性比多抗稳，做多批次动物实验时这一点很省心。
重组单抗的另一个好处是用量省。同一批实验跑几十张膜，批间不用重新定条件。
IHC 两种样本差四倍
石蜡切片写 1/50 到 1/100，冰冻切片写 1/200，差了四倍。
原因是修复。石蜡切片要热修复，抗原决定簇被甲醛交联遮掉一部分，抗体浓度得往上提。冰冻切片没经过固定交联，浓度反而可以降。
两个数不要互换。把石蜡的 1/50 用到冰冻片上，背景会一片糊。
Dot blot 那栏是 1/1000。这个应用在磷酸化抗体验证里很实用，点样量少，能快速看抗体认不认目标。
Dot blot 那一栏还有个用法。验证新批号时点几个梯度，半小时能出结果，比跑整块胶快得多。
三条操作建议
取材要快。动物处死后立即取组织、立即冻，或者直接灌流固定。中间拖十分钟，磷酸化数据就不能用了。
裂解液里的磷酸酶抑制剂现用现加。配好的母液放两天效果就掉，这一点在最容易出问题的环节上。
做 IHC 前先跑一张 WB 确认这批组织里信号有差异，再上切片。切片一批几十张，返工代价大。
把这三件事写进 SOP，新人接手也能跑出一致的磷酸化数据。
下次做营养干预实验，把禁食时间、取材时间、冻存时间三栏写进记录表，每只动物都填。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse |
| 抗原名称 | MTOR pS2448 |
| 验证应用 | WB, IHC, Dot |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/50 - 1/100 Perform heat-mediated antigen retrieval before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/1000 - 1/10000；IHC-Fr 1/200；Dot 1/1000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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